周苗苗
（皖西卫生职业学院；安徽六安237005）
【摘要】目的：探究尿素酶在眼组织中的表达，并分析泪膜尿素减少和干眼症之间的关系。方法：择取2017年8月到2020年9月期间于笔者所在医院治疗干眼症的40例患者，设其为研究组；择取同期于笔者所在医院接受眼科检查的健康受检者116例，设其为对照组。为两组研究对象采集眼泪标本、房水标本与血清样本，进行免疫组化染色，并通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定眼表组织与泪腺的尿素酶（包括鲱精胺酶与精氨酸酶-1,精氨酸酶-2）表达。结果：尿素酶——鲱精胺酶与精氨酸酶-1,精氨酸酶-2于两组研究对象的所有眼组织中均有表达，精氨酸酶-1于角膜中无表达。眼泪中的尿素浓度和房水尿素浓度、血清尿素浓度均无相关性，但房水尿素浓度、血清尿素浓度之间则有相关性。此外，研究组患者的眼泪尿素浓度低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：尿素可以由眼泪中含有的尿素酶独自生成，泪膜尿素减少可导致干眼症，而维持泪膜尿素浓度则可以预防和缓解干眼症。
【关键词】尿素酶；眼组织；表达；泪膜尿素减少；干眼症；关系
基金项目：1.2019高校优秀青年骨干人才国内访问研修项目（gxgnfx2019121）
2.2019年高等学校省级质量工程项目：周苗苗技术技能型大师工作室（2019dsgzs10）
3.高等学校省级质量工程支持疫情防控期间高校线上教学工作特需项目-重大线上教学改革研究项目：高职院校医学生在线教学中深层次学习发生的策略研究（2020zdxsjg374）
作者简介：周苗苗（1978.1-），性别：女，学历：硕士研究生，职称：副教授、主治医师，研究方向：五官科诊疗及教学。
通讯作者：周苗苗，E-mail：68627674@qq.com。
干眼症即角结膜干燥症，是指因某些原因而导致泪液在质、量或动力学上出现异常进而导致泪膜丧失正常稳定性并伴有眼表组织病变与眼部不适症状的多种疾病的总称，用眼过度、激素水平平变化、免疫炎症反应以及外界环境等均可诱发干眼症[1]。马秀丽在其研究中指出，糖尿病与慢性肾衰可能与干眼症有一定的联系，患者多伴有血清尿素浓度的变化。然而，此类研究目前数量较少，因此本文结合马秀丽等人的研究成果，选择2017年8月到2020年9月期间收治的40例干眼症患者，试探讨尿素酶于眼组织中的表达以及泪膜尿素减少和干眼症之间的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
择取2017年8月到2020年9月期间于笔者所在医院治疗干眼症的40例患者，设其为研究组；择取同期于笔者所在医院接受眼科检查的健康受检者116例，设其为对照组。为两组研究对象进行临床资料的对比：研究组：男性患者21例，女性患者19例；年龄最小25岁，最大75岁，平均（50.34±12.66）岁。对照组：男性受检者62例，女性受检者54例；年龄最小26岁，最大74岁，平均（50.42±12.57）岁。对比两组研究对象的如下基线资料——年龄分布、性别构成，差异全部不存在统计学意义（P＞0.05），可进行统计学对比。
纳入标准：①对照组无干眼症状，未使用人工眼泪、润湿剂或润滑剂，除屈光不正与白内障外未患有其他疾病[2]；②研究组经裂隙灯、眼透镜、眼角泡沫覆盖物形态学检查、眼泪分泌试验以及荧光染色观察，确诊为干眼症；③研究组患者至少有6个月以上病史且存在至少3个月以上的视力模糊、刺痛、灼痛等临床表现。
排除标准：①患有代谢性疾病的患者；②患有自身免疫性疾病如干燥综合征的患者；③患有葡萄膜炎、角结膜炎或青光眼等眼部疾病的患者[3]。
1.2 方法
对照组仅采集眼泪标本，研究组采集眼泪标本、血清标本与房水标本，其中眼泪标本使用细管收集，给予离心操作并放置在4℃的环境中保存，留待检验分析；房水标本则使用27g套管及与套管连接的注射器采集，安排专业眼外科医生为研究对象进行穿刺，获取前方房水约0.5~1mL；血液标本则在术前的20~24小时采集。
使用RT-PCR技术，将眼组织样本中的结膜、角膜和泪腺于低温液态氮环境下放入玛瑙研钵中研磨为细粉末状，取5mLRNA放入均质器中使其均匀溶解，并将无法溶解的物质通过立新方式移除。使用Rneasy-Kit盒将总RNA分离出来，使用异丙醇将RNA纯化并以酒精进行反复沉淀。经由RNase将DNase I释放出来，将污染的DNA去除。DNase酶加热到65℃，15分钟后将会变性，将0.5mgRNA用于催化反应。随后，将50ng/μL寡核苷酸15（作为引发剂）与0.8μL的RNase H逆转录酶放入37℃环境，1小时后将会产生cDNA[4]。
使用传统PCR技术，将1μL的cDNA应用到如下试剂中进行孵化：①纯净水，13.7μL；②氯化镁溶液，50mmol/L；③dNTP，0.5μL；④10*PCR缓冲液，2μL；⑤Taq DNA聚合酶，0.3μL（约5U）；⑥引发剂——精氨酸酶-1、精氨酸酶-2、鲱精胺酶[5]。
为泪腺上睑结膜与角膜组织进行甲醛固定并以石蜡进行包埋，切割石蜡标本使其成为厚度4μm的切片，随后使用二甲苯脱蜡。使用反精氨酸酶2、反精氨酸酶1以及反鲱精胺酶IgG作免疫组化染色，切片先使用胰岛素进行5分钟的预处理，随后将其进入三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水溶液（1:3）浸泡，并以山羊血清进行孵育，以便使非特异性结合物无法形成。初级抗体在室温下进行整夜孵育，次级抗体则孵育4小时以上。使用过氧化物酶对抗生蛋白链菌速-生物素、二氨基联苯进行标记并对其进行5分钟的目测。随后对血补体进行复染，同样行切片包埋。最后使用显微镜对载玻片进行观察。
使用尿素/铵试剂盒对眼泪标本、血清标本、房水标本进行尿素浓度检测，由于尿素是由尿素酶水解为尿素与二氧化碳的，因此标本中的尿素可以在谷氨酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二苷酸的氧化反应下与2-酮戊二酸共同形成L-谷氨酸，借助吸收光谱法在340nm下测定便可获得实际尿素浓度。
1.3 观察指标
（1）对比两组研究对象的鲱精胺酶与精氨酸酶-1、精氨酸酶-2在眼组织中的表达；
（2）对比两组研究对象眼泪尿素浓度、房水尿素浓度、血清尿素浓度之间的联系；
（3）对比两组研究对象的泪膜尿素浓度并分析泪膜尿素减少和干眼症之间的关系。
1.4 统计学方法
纳入到实验研究中的患者其所有临床数据均以21.0版本的SPSS统计学软件包进行检验。其中计数资料均以（n，%）表示，行卡方值检验。而计量资料则以（±s）表示，行t值检验。若两组数据在统计计算后得到P＜0.05的结果，则分组结果均存在统计学意义。
2 结果
2.1 眼组织中鲱精胺酶、精氨酸酶-2、精氨酸酶-1的蛋白表达与mRNA表达
尿素酶的测定涉及到尿素的产生，使用RT-PCT技术对人角膜上皮细胞、角膜细胞、结膜以及泪腺进行检查，可以发现：①精氨酸酶1在泪腺与结膜这两种眼组织中有mRNA表达，但是在角膜细胞与人角膜上皮细胞这两种眼组织则无mRNA表达；②精氨酸酶-2与鲱精胺酶在角膜细胞、人角膜上皮细胞、结膜以及泪腺上均有mRNA表达。
通过免疫组化染色可知：①精氨酸酶-1会催化水解为L-精氨酸，进而进一步生成尿素与L-鸟氨酸，而尿素在结膜上皮细胞及泪腺泡细胞上均有蛋白表达，在内皮细胞、角膜细胞、角膜上皮细胞上则无蛋白表达；②精氨酸酶-1在角膜上皮细胞上无蛋白表达，而鲱精胺酶和精氨酸酶-2在泪腺腺泡细胞与结膜上皮细胞上有表达，在杯状细胞上无表达，在角膜细胞与内皮细胞上无表达；③尿素酶在全部泪腺腺泡细胞上均无表达，鲱精胺酶在上皮细胞质中有表达。综上所述，精氨酸酶-1仅在泪腺与结膜上有表达，而精氨酸酶-2与鲱精胺酶则在角膜、结膜与泪腺上均有表达，PCR结果也与上述免疫结果相同。
2.2 眼泪尿素浓度、房水尿素浓度、血清尿素浓度相关性
泪膜尿素浓度为（59.99±25.89）mg/dl，房水尿素浓度为（41.71±19.91）mg/dl，血清尿素浓度为（49.98±25.89）mg/dl。对三者进行相关性分析，泪水尿素浓度与房水尿素浓度之间无相关性（r=0.1，P=0.6＞0.05）；泪水尿素浓度与血清尿素浓度之间也无相关性（r=0.5，P=0.05=0.05）；而房水尿素浓度则与血清尿素浓度有相关性（r=0.7，P=0.0＜0.05）。
.png)
2.3 泪膜尿素减少和干眼症之间的关系
研究组的眼泪尿素浓度为（27.78±8.56）mg/dl，对照组的眼泪尿素浓度为（42.01±12.79）mg/dl，研究组低于对照组，差异有统计学意义（t=5.848，P=0.000＜0.05）。
3 讨论
氨基酸与蛋白质降解的最终产物即为尿素，L-亮氨酸的代谢产物也是尿素，其代谢途径有两条，其一是精氨酸在精氨酸酶的代谢下生成L-亮氨酸与尿素，其二为在经酸酸脱羧酶的代谢下生成胍基丁胺，在由鲱精胺酶进行转化，生成尿素与四甲烯二胺[6]。而精氨酸酶有2组亚型，即精氨酸酶-1与精氨酸酶-2，二者可以对统一化学反应进行催化。据现有成果可知，90%的尿素可以经肾脏排泄出去，其余则从小肠与汗液中排到体外[7]。事实上，尿素既是一种代谢废物，同时也可以提供与水结合的亲水部分，有了足量的尿素，细胞膜的脂质双层结果才能得到保证。尿素自身并不具备表面活性，主要是借助表面结合蛋白来为分子表面造成影响。若是尿素不足，则会引发各种皮肤病[8]。在细胞的角化过程中，尿素是经由部分精氨酸与特殊氨基酸来降解的，若是精氨酸不足，尿素浓度将会明显减少，皮肤将会丧失保留水分的能力。而泪膜是黏膜中的一种，若是尿素浓度降低同样会使其“干涸”[9]。而马秀丽在其研究中指出，精氨酸酶1、精氨酸酶-2和 鲱精胺酶这三种酶可以生成尿素，这三者可以促进细胞生长代谢与伤口愈合[5]。从结果可知，泪膜尿素浓度与血清尿素浓度、房水尿素浓度均无相关性（r=0.1，P=0.6＞0.05）（r=0.5，P=0.05=0.05），可见泪膜尿素的分泌是独立的。患有干眼症的研究组患者其眼泪尿素浓度低于健康的对照组受检者的眼泪尿素浓度（t=5.848，P=0.000＜0.05），可见泪膜尿素减少和干眼症之间有着非常密切的联系，泪膜尿素的减少会诱发干眼症或是干眼症加重。
结语：
眼泪尿素浓度增加会使泪膜不稳定，而尿素浓度增加的原因是尿素转运体表达在催化作用下出现了改变；泪腺中若是缺少了尿素复合物，泪腺尿素减少，则同样会导致泪膜不稳定，进而引发干眼症。因此，维持尿素稳态是非常重要的，临床可以通过增加眼泪尿素浓度来实现对干眼症的有效治疗。
【参考文献】
[1]储俐,李妍.干眼症的中医脏腑论治研究进展[J].中医眼耳鼻喉杂志,2015,5(04):211-212.
[2]郑敏明,许燕.干眼症患者的临床特征分析[J].现代医药卫生,2017,33(01):108-110.
[3]左春兰.干眼症的相关因素分析[J].中国实用眼科杂志,2015,33(s1):1-3.
[4]马骎,宁晓玲,侯康.眼科门诊40岁以下人群干眼症的危险因素分析[J].国际眼科杂志,2017,17(01):157-160.
[5]马丽秀,韩福胜,李月光,等.尿素酶在眼组织中的表达及泪膜尿素减少与干眼症的关系分析[J].河北医药,2015,37(23):3531-3534.
[6]Narayana J L, Huang H N, Wu C J, et al. Efficacy of the antimicrobial peptide TP4 against Helicobacter pylori infection: in vitro membrane perturbation via micellization and in vivo suppression of host immune responses in a mouse model[J]. Oncotarget, 2015, 6(15):12936-12954.
[7]Galor A, Felix R E, Feuer W, et al. Dry eye symptoms align more closely to non-ocular conditions than to tear film parameters[J]. Br J Ophthalmol, 2015, 99(08):1126-9.
[8]朱建红.中老年干眼症患者的临床特征分析[J].世界临床医学,2015,9(05):134-135.
[9]Minako K, Ikuko T, Tomoo O, et al. Reducing Short-Wavelength Blue Light in Dry Eye Patients with Unstable Tear Film Improves Performance on Tests of Visual Acuity:[J]. Plos One, 2016, 11(04):e0152936.