童宁 张迪通讯作者
（青海省心脑血管病专科医院检验科；青海西宁810000）
摘要 目的 对多发性肠系膜静脉栓塞患者及其家系进行相关检查和基因诊断，分析其所患易栓症类型以及与遗传的相关性。方法 对该家系7人用发色底物法对蛋白C活性（PC:A）、抗凝血酶活性（AT:A）和蛋白S活性（PS:A）分别进行检测，用Western blot 检测血浆中的抗凝血酶含量和分子量，用Trizol法提取患者及家系成员外周血全基因组DNA，对抗凝血酶的7个外显子及其侧翼序列使用PCR扩增，用直接测序法对患者的AT扩增产物进行测序分析和基因突变分析。结果 该患者（II2）的AT含量正常, AT:A为49%，经AT基因序列的突变分析未发现突变位点，其他检测结果正常；患者弟弟（II3）AT:A为45%，其他检查结果正常。该家系其他成员的PC:A 、PS:A 、AT:A及AT含量均正常。结论 根据易栓症相关检测结果及基因序列突变分析，患者与其弟弟有车祸外伤史（分别为髂骨骨折和肋骨骨折）等获得性诱因存在，该两患者不存在AT基因突变，诊断为获得性易栓症。
关键词 易栓症，获得性易栓症，肠系膜静脉栓塞
1965年Egeberg O.在报道一个家族性抗凝血酶(antithrombin，AT)缺陷症时第一次提出易栓症（thrombophilia）一词。易栓症是指有发生静脉血栓栓塞症倾向的一类疾病，据有无遗传性倾向和有无获得性因素存在，可分为遗传性易栓症和获得性易栓症。获得性易栓症是获得性因素导致的易栓症，常见诱因有创伤或有手术史、长时间止动、年龄增加、妊娠期或产褥期以及长期口服避孕药或激素等；还有一些疾病同样容易诱发易栓症，如：获得性抗凝蛋白缺乏、抗磷脂综合症、获得性凝血因子升高、肾病综合症、糖尿病等。而遗传性易栓症是存在常染色体显性家系遗传的易栓症，伴有相关蛋白的基因突变，常见有蛋白S缺陷、抗凝血酶缺陷、蛋白C缺陷、FV Leiden突变和凝血酶原20210A突变等。国内研究报道的易栓症家系仍不多，本研究拟以一个易栓症家系进行研究，分析其抗凝血酶活性、蛋白C活性和蛋白S活性等进行表型诊断，检测其基因序列进行基因突变分析，以确定其所患易栓症的类型，并探讨基因诊断在易栓症类型诊断中的应用。
1.资料与方法
1.1患者及家系资料
患者（II2），男，汉族，32岁，于2008年在车祸中导致左侧髂骨及盆腔骨折，经手术后在家休养，随后出现腹痛等症状，经血管造影与CT等检查诊断为肠系膜静脉血栓。于 2012年底因右侧腹部剧烈胀痛再次入院治疗，行剖腹探查，发现结肠段肠系膜出现血栓栓塞。术后行溶栓治疗，出院后给予华法林维持治疗半年，每月监测凝血机制一次。患者弟弟(II3)，男，汉族，28岁，同在2008年车祸中导致两根肋骨骨折，康复后于2009年出现下肢肿胀疼痛，经彩色多普勒超声和CT检查发现右下肢存在静脉栓塞。该家系其他成员无静脉血栓史。家系图见图1。
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1.2相关检测指标：
在获得该家系所有成员的知情同意后，对家系成员7人分别采用负压静脉采血（干燥管采血5ml、乙二胺四乙酸抗凝管采血2ml、枸橼酸钠抗凝管采血2.7ml 1管。），并留取晨尿标本各10ml。干燥管及枸橼酸钠抗凝管血液样品，立即3000r/min离心10分钟。尿液样本进行尿液分析（长春迪瑞试剂，长春迪瑞H800型尿液分析仪），血样进行血液细胞分析（日本Sysmex2100型流水线血液分析仪）、凝血四项(含PT、APTT、TT、FIB；)和D-D二聚体检测（法国Stago公司试剂，法国Stago公司STA-R Evolution型全自动血凝仪）、蛋白C活性（PC:A）和蛋白S活性(PS:A)及AT活性检测（采用发色底物法，法国Stago公司试剂盒，法国Stago公司STA-R Evolution型全自动血凝仪）、血糖、肝肾功能、同型半胱氨酸(HCY)含量检测(四川迈克生物科技股份有限公司试剂，日本日立7600型全自动生化分析仪)、狼疮抗凝物（LA）及抗心磷脂抗体检测（北京贝尔试剂盒，德国Biotek酶标仪）等。
1.3 用Western blot检测血浆中AT含量：
从-80℃冰箱取出冻存的该家系成员7人的枸橼酸钠抗凝血浆，将血浆进行20倍稀释（用磷酸盐缓冲液稀释），与上样缓冲液3：1混合，置入100℃沸水中煮沸5min，使蛋白变性为蛋白单体。然后进行蛋白电泳（10%SDS-PAGE，60V,55mA）3.5h，再经湿转法进行转膜电泳(60V,160mA)3h，使电泳后的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上。用5%脱脂牛奶粉溶液（伊利脱脂奶粉0.5g，TBST 10ml）封闭2h,经彻底洗净，用抗AT的一抗（Antithrombin Ⅲ Rabbit Monoclonal Antibody与PC Rabbit Antibody,美国EPIT MICS试剂，An Abcam公司）在4℃冰箱孵育过夜，经彻底清洗后用二抗（HRP标记的goat anti-rabbit IgG，上海生工公司分装）孵育2h。彻底清洗后用DAB显色液（北京中杉金桥）显色15分钟。同时进行-actin的内参照显色，阳性条带呈现棕色后加蒸馏水洗涤终应。图像采集使用美国 ALPHA凝胶成像系统进行扫描拍照。蛋白质分子量标记采用彩色预染蛋白质Marker(11-180kD)。
1.4全基因组DNA抽提：
取该家系成员外周血（枸橼酸钠抗凝）各200ul，使用欧盟Fermentas DNA提取试剂盒提取全基因组DNA，严格按照试剂说明书操作提取。
1.5 PCR扩增及产物纯化：
AT基因的7个外显子的扩增引物序列参照文献报道[1]，并使用Primer5引物设计软件进行优化设计，引物信息见表1。PCR总体系为25ul：引物终浓度为0.2umol/L，模板DNA 50ng，Taq酶为1.25U（北京TIANGEN），dNTP终浓度为0.25mmol/L，MgCl2终浓度为1.5mmol/L。反应条件：95℃预变性5 min，然后95℃ 30s，57℃退火30s(经反复预实验，第3外显子采用62℃退火，第5外显子采用60℃退火)，72℃延伸30s,30个循环，72℃延伸10min。取PCR产物80ul，加入20ul loading buffer(4:1)混合,进行琼脂糖电泳（18g/L琼脂糖，含溴化乙锭）30min，应用美国 ALPHA凝胶成像系统进行扫描拍照，图2。将患者的相应电泳条带在254nm紫外灯下切取，用QIAquick Extracion Kit试剂盒进行PCR产物回收、纯化（美国QIAGEN公司）。
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1.6 AT基因测序及突变分析：
PCR纯化后产物,进行正向和反向测序（测序仪器为美国ABI公司3730xl基因分析仪，试剂为BigDye terminator v3.1，测序图谱分析采用Chromas软件。）。患者AT基因测序后的结果，使用BLAST在线工具与美国国家生物信息中心（NCBI）公布的AT基因标准序列(Genbank:X68793.1)进行比对，进行基因突变分析。
1.7排除FV Leiden突变和凝血酶原G20210A突变：
对患者进行FV Leiden突变检测：采用引物为F, 5’CCATTATTTAGCCAGGAGACC3’，R, 5’ATTGGTTCCAGCGAAAGC3’；对外显子10及侧翼序列进行扩增（退火温度60℃）和测序分析。同时进行凝血酶原G20210A突变检测：采用引物为F,5’TCTAGAAACAGTTGCCTGGC3’, R,TCCAGTAGTATTACTGGCTC3’；对外显子14及侧翼序列进行扩增（退火温度53℃）和测序分析。
2.结果
2.1相关检测结果：
患者(II2)检测结果：AT:A 49%, PC:A 125%, PS:A 117%, PT 11.9s,INR 0.99,APTT 40.7s,TT 15.5s,FIB 2.89g/L；血液细胞分析、肝肾功能等无明显异常，血糖、尿液分析、D-D二聚体、狼疮抗凝物、抗心磷脂抗体、同型半胱氨酸等检测结果均正常。患者（II3）检测结果：AT:A 45%, PC:A 97%, PS:A 126%,其他检查正常。该家系7人中有2人表现为AT:A的降低，而其他成员的AT、蛋白C和蛋白S活性等检测结果均正常。
Western blot检测结果显示：该家系7名成员的AT蛋白在58kD区域处存在与正常人对照分子量一致的特异性条带(Ⅱ1、Ⅲ1、Ⅲ2未显示)，AT蛋白条带阳性强度经美国 ALPHA凝胶成像系统进行灰度值扫描与正常人条带扫描结果接近（见图3）。说明该患者（Ⅱ2）的血浆中AT量和分子量正常，检测结果与AT抗原含量检测一致，仅表现为AT活性降低。
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2.2 测序结果及突变分析：
将患者AT基因7个外显子的测序后的结果，与AT基因标准序列(Genbank:X68793.1)进行比对分析；用BLAST工具将测序序列转化成氨基酸序列，与美国国家生物信息中心（NCBI）公布的AT氨基酸序列进行比对，均未发现AT基因突变位点和氨基酸序列异常。
2.3 FV Leiden突变和凝血酶原G20210A突变分析：
对患者（II2）的FV基因第10外显子和凝血酶原基因第14外显子进行PCR扩增、产物测序，未发现FV Leiden突变和凝血酶原G20210A突变。
3.讨论
AT能够灭活凝血酶、FXa等因子，具有抗凝血作用，与肝素结合后可使抗凝血作用增加数千倍以上[2]。有研究报道[3]:AT有两个重要的功能区，一个是位于羧基（C）端的反应位点,AT的反应位点在P1（Arg393）位和P1’(Ser394)位，P1通过与凝血酶活性中心的Ser结合，形成稳定的AT-凝血酶复合物，而灭活凝血酶; 另一个是位于氨基（N）端的肝素结合区。据研究发现AT在血液中的浓度较低，此时AT的抗凝活性较小，但在有肝素分子存在的情况下，能够与肝素中的戊糖（pentasaccharide）序列结合，AT的构象发生改变，反应中心环（RCL）暴露，能够最有效的发挥抗凝作用[4- 6]。
易栓症的发生可以是单因素导致发病，亦常常是几种诱因共同作用导致发病，可以是多种获得性诱因或遗传性因素的作用，也可以是获得性诱因和遗传性因素的共同作用。大多数情况下，易栓症患者的发病常常是受到了获得性因素的影响，如手术、创伤、长期慢性腹泻、弥漫性血管内凝血（DIC）、肝脏疾病、肾病综合症、抗磷脂综合症、妊娠、口服避孕药及雌激素、恶性肿瘤等。获得性易栓症亦指获得性血栓危险因素或获得性易栓状态。各种不同类型手术静脉血栓的发生率差异较大，尤其是骨外科和神经外科手术，如下肢和骨盆骨折、膝关节和髋关节手术、脑外伤等的血栓发生率为最高；长时间飞行后也易发生静脉血栓的现象称为“经济舱综合症”；瘫痪、久病在床、术后卧床、石膏长期固定的病人，由于血流淤滞，也易发生静脉血栓。此外，遗传性因素方面，也可引起家族型易栓症，如：AT基因突变可以导致AT胞内滞留而不能发挥抗凝作用、AT蛋白的分泌障碍，还可以使AT的反应位点异常变异而致活性降低，使AT的肝素结合位点异常变异而致与肝素亲和力降低。有时，在易栓症的获得性和遗传性因素并存情况下，血栓形成的危险性明显增高。
该家系两个患者AT基因测序结果显示：患者（II2）与患者（II3）的PC:A、PS:A检测均正常可排除PS和PC蛋白异常的影响，肝肾功能、血糖、凝血四项、抗心磷脂抗体、LA、同型半胱氨酸和D-D二聚体等均正常可排除其他疾病的影响，经基因突变分析未发现AT基因突变、凝血酶原G20210A突变和FV Leiden突变，仅有AT:A活性降低，而患者有骨折史、手术史是获得性易栓症发病的一些重要诱因。该两个患者家族史阴性，家系其他成员经相关检测均正常，可以排除遗传性易栓症的影响，综合所有检测该两个患者诊断为获得性易栓症。术后给予抗凝、溶栓治疗两周，好转后每月监测一到三次凝血机制，出院后继续适当服用抗凝药物（如，华法林等）适量进行预防性用药半年。
综上所述，该文研究了一个多发性肠系膜静脉栓塞症患者及其家系，其中有两人的AT:A减低而AT基因序列检测未发现AT基因突变，排除了遗传性因素的影响。本文为以后获得性易栓症与遗传性易栓症的鉴别诊断提供了参考，为今后易栓症的深入相关研究提供了病例资料。
参考文献：
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