张芳玲
?（南京中医药大学附属南京医院眼科；江苏南京210003）
【摘要】 目的 探讨丹参酮ⅡA对N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的大鼠原代视网膜神经节细胞损伤的保护作用。方法 体外培养大鼠原代视网膜神经节细胞，以终浓度为5μg /mL的丹参酮ⅡA预保护12h后，用NMDA(100μmol/L)诱导损伤，并设正常对照组，单纯损伤组和地卓西平(MK-801)对照组。倒置显微镜下观察细胞形态；MTT比色法测定细胞存活率；Hochest染色检测细胞凋亡，结果 NMDA可诱导视网膜神经节细胞损伤。与单纯损伤组比较，丹参酮ⅡA预保护组可提高大鼠原代视网膜神经节细胞存活率，减少细胞凋亡（P<0.05）。结论 丹参酮ⅡA可抑制NMDA诱导的视网膜神经节细胞凋亡，保护视网膜神经元。
【关键词】 丹参酮ⅡA；视网膜神经节细胞；N-甲基-D-天冬氨酸
The protective effects of Tanshinone ⅡA against NMDA-induced cell apoptosisin in cultured retinal ganglion cells*
ZHANG Fangling Department of Ophthalmology ,The Second hospital of NanJing, NanJing University of Chinese Medine, Jiangsu 210003,CHINA
【Abstract 】 Objective To investigate the protective effects of Tanshinone ⅡA against NMDA-induced cell apoptosis in cultured retinal ganglion cells. Methods In cultured retinal ganglion cells were pretreated with Tanshinone ⅡA（5μg/mL）for 12h and exposed to NMDA（100μmol/L）for 30min. The normal cultured retinal ganglion cells, NMDA treated and MK-801 treated retinal ganglion cells were used as control. The protective effects were observed by invert microscope, MTT assay and Hoechst staining. Results Exposure of cultured retinal ganglion cells to NMDA may induce neuronal injury. Pretreated with Tanshinone ⅡA (5μg/mL) greatly improved the viability of cultured retinal ganglion cells and attenuated the apoptosis of cultured retinal ganglion cells. Conclusion Tanshinone ⅡA could inhibit the apoptosis of cultured retinal ganglion cells induced by exposure to NMDA.
【Key words】 Tanshinone ⅡA; Retina ganglion cells; N-methyl-D-aspartate
视神经是中枢神经的代表,很多疾病如青光眼，炎症病变，创伤，缺血及肿瘤压迫等均能严重损伤视神经，造成视力丧失，如何有效地保护视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cells ＲGCs)、促进其轴突再生延长、建立突触联系，进而恢复视功能一直是国内外学者关注的焦点,而其根本在于有效地保护并挽救损伤的ＲGCs，使其免于凋亡，这是保存与恢复视功能的前提[1]。为此选择一种药物能有效地预防，阻断，逆转这种病变是治疗此类疾病的关键，也是目前研究的热点之一。
丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA）是从丹参中提取的主要化学成分，丹参为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、活血通经等功效。现代药理学研究证明，丹参具有扩张冠脉血管、保护心肌、抗脑缺血、抑制血栓形成、改善微循环和抗氧化等药理作用[2]，临床上主要用于治疗心脑血管类疾病。本实验采用N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导体外培养的RGCs凋亡，观察丹参酮ⅡA对原代培养的视网膜神经节细胞的保护作用。
材 料 与 方 法
一、材料
实验动物：出生1～3 d 的SD乳大鼠，雌雄不限，清洁级。由南京中医药大学实验动物中心提供
主要仪器：超净工作台(SW-CJ 苏州安泰空气技术有限公司)；CO2 恒温培养箱(Heraeus，德国)；相差倒置显微镜(Leica，德国)；荧光显微镜(LeicaDM4000B，德国)；Leica QWin Plus V3.5 图像分析系统(Leica，德国)。
主要试剂：(1)药品：丹参酮ⅡA（悦康药业集团有限公司）；(2)培养液：高糖型DMEM粉剂和胎牛血清(Gibco公司)；(3)小鼠抗大鼠Thy1.1单克隆抗体(eBioscience公司)； (4)NMDA、地卓西平(MK-801)、多聚赖氨酸、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、Hoechst33258 (Sigma公司)；(5)6孔板、96孔板培养皿(Costar 公司)。
二、方法
（一）RGCs 纯化及体外培养：SD大鼠断头处死，无菌条件下摘除眼球，解剖显微镜下依次去除角膜、晶状体和玻璃体， 钝性分离视网膜神经上皮层，0.125%胰蛋白酶-EDTA，15 U/ml 木瓜蛋白酶于37℃下消化20min，终止消化后，1000r/min离心5min，去上清液，PBS清洗2次， 加入适量DMEM完全培养液。重悬后，置于小鼠抗大鼠Thy-1.1单克隆抗体包被的培养皿中，室温孵育30 min。轻轻吸掉未黏附的细胞悬液，PBS轻洗3次。用含0.125%胰酶轻轻冲洗培养皿，DMEM完全培养液终止消化。1000r/min离心5min，调整细胞密度为1×106/ml，接种于多聚赖氨酸包被的96孔板、6孔板培养皿中，置于5%CO2培养箱(37℃恒温及饱和湿度)中培养，相差倒置显微镜观察活细胞形态及生长规律。
（二）MTT比色法测定细胞存活率：将1×l05/ml RGCs种植在96孔培养板内，贴壁后将细胞分为四组：正常对照组、丹参酮ⅡA预保护组、单纯损伤组、地卓西平对照组。每组设6个复孔。丹参酮ⅡA预保护组加入丹参酮ⅡA溶液，使其终浓度分别为5μg/mL。地卓西平对照组加入含MK-801的DMEM完培,使其终浓度为10μmol/L。正常对照组和单纯损伤组加入单纯DMEM完培，置于37℃, 5%CO2细胞培养箱内培养12h。取出细胞后弃培养基，PBS冲洗3遍，除正常对照组以外，其余各组均加入NMDA120μmol/L和甘氨酸15μmol/L作用40min，PBS冲洗3遍后，恢复到原来的培养液环境。培养36h后每孔加入新鲜配置的MTT(5mg/ml)25μl，用酶标仪在波长490nm处测定吸光度(OD值)，计算细胞存活率。
（三）Hoechst染色：将培养在盖玻片上的细胞按上述方法分组和处理后，以4%多聚甲醛固定，PBS冲洗三次，加入Hoechst33258工作液染色，漂洗后封片，于荧光显微镜下观察结果。在荧光显微镜下，活细胞核呈椭圆形，被染成均匀的蓝色荧光,而凋亡细胞核固缩，呈浓染的亮蓝色颗粒块状荧光。随机取6个视野计数，并计算凋亡百分率。
统计学处理
采用Stata18.0统计软件分析，计量数据用均数±标准差(X±S )表示，行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、 细胞形态观察
相差倒置显微镜下观察， 正常状态下RGCs于2～4h开始贴壁，贴壁后细胞呈圆形，单层生长，胞体中部较暗，光晕明显，12～24h后完全贴壁；48h后细胞体积明显增大，开始伸出粗细长短不等的突起；72h后形成典型突起并不断伸长，可见明显的生长锥。随着细胞的生长，突起互相连接。NMDA组，细胞皱缩、变圆，轴突变短或者消失。丹参酮ⅡA组细胞部分出现皱缩变形，但程度较轻，较多细胞仍保持正常细胞轮廓。
二、细胞活性检测
与NMDA组比较，丹参酮ⅡA组，地卓西平组细胞生存率提高（P<0.05），
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讨 论
视神经损伤后,ＲGCs障碍，甚至凋亡，视觉信息的整合和传递就会受到损害，从而导致视力受损[3]。视神经损害的最后共同通路是RGCs的凋亡，进而引起视功能的损害。因此，在治疗此类疾病的关键是有效保护和恢复RGCs的功能，即视神经保护，使那些未受损的、仅部分受损的、或临近死亡的RGCs得以存活或延长生存时间[4]，本文细胞培养体系中，除了RGCs还混合有一定量视网膜中其他种类细胞，但这一培养体系与完全纯化培养的RGCs体系相比， 在一定程度上更加符合RGCs在体内的生存环境，因此，本实验结果从某种程度来说更具有代表意义。
丹参酮ⅡA是近年来国内外研究开发的热点之一,大量研究表明，丹参酮ⅡA 有多种生物学活性，对脑神经具有保护作用，如抗氧化、防止神经细胞凋亡、维持脑内离子稳态、保护血脑屏障等，是潜在的神经保护中药单体。有学者发现丹参酮ⅡA预处理可促进缺血后星型胶质细胞活化增生，减轻缺血性脑损伤［5］。也有学者发现丹参酮预处理可以通过减少神经节细胞的凋亡，对视网膜缺血再灌注损伤起保护作用，其作用机制可能是通过调节Bcl-2 的表达来实现［6］。在本次实验中，我们通过观察细胞形态，发现经过丹参酮ⅡA预保护的RGCs在NMDA作用后细胞损伤明显减轻，可有效提高视网膜神经节细胞存活率，减少NMDA诱导的细胞凋亡，该结果与我们的前期实验[7]的研究结果基本相同。
本实验通过NMDA诱导成功建立损伤模型，并证实丹参酮ⅡA能抑制NMDA诱导的细胞凋亡，为下一步的体内研究和临床应用提供理论依据，但具体机制还需进一步探讨。
参 考 文 献
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[3] 陈卫银，孙承铭，王会民，等． 丹参酮ⅡA 预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠神经保护作用及GFAP 表达的影响［J］． 山东医药，2011，51( 8) : 35-37．
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