云南地区非小细胞肺癌外周血EGFR基因突变检测分析

发表时间:2019/9/22   来源:《中国保健营养》2019年第4期   作者:崔静1 杨丽琳1 宋蜀伶2 方 虹3
[导读] 【摘 要】 目的:探讨云南地区非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血中表皮因子生长受体(EGFR)基因突变情况。方法:收集2017年10月-2019年7月本院云南地区晚期NSCLC患者外周血标本37例,运用ARMS-Taqman 探针法检测标本中EGFR 基因突变情况。
(中国人民解放军联勤保障部队第九二○医院病理科     云南昆明    650032)
 
  【摘    要】    目的:探讨云南地区非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血中表皮因子生长受体(EGFR)基因突变情况。方法:收集2017年10月-2019年7月本院云南地区晚期NSCLC患者外周血标本37例,运用ARMS-Taqman 探针法检测标本中EGFR 基因突变情况。结果:37例血液标本中,14例(37.8%)存在EGFR基因突变,其中19Del占总突变的28.6%(4/14),L858R 占总突变的42.8%(6/14),L858R、19Del占总突变的71.4%(10/37),有2例同时存在L858R、T790M突变;2例同时存G719X、S768I 双突变14.3%(2/14);2例存在L861Q突变14.3%(2/14)。结论:云南地区外周血EGFR 基因突变检测率与国内其他报道一致,主要以EGFR基因L858R及19Del突变为主;但云南地区的S768I 则明显高于其他地区。
  【中图分类号】R821.4+2      【文献标识码】A      【文章编号】1004-7484(2019)04-0091-02
  肺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的80%~90%,恶性程度高。在我国,肺癌已成为恶性肿瘤第一死因,而云南省的肺癌发病率与死亡率一直在国内位居榜首,特别是云南宣威地区,发病率是全国平均水平的20倍。70%~80%的NSCLC患者确诊时已处于晚期,失去了手术治疗或根治性放疗的机会,晚期NSCLC全身化疗中位生存期仅为8~10个月。随着对肺癌生物标志物的深入研究和致病机理的逐步阐明,分子靶向治疗已经成为肺癌综合治疗中的最新模式,受到广泛关注。目前NSCLC治疗的重要方向之一是以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的分子靶向治疗。EGFR基因突变主要发生在18~21外显子, 大量临床研究显示检测EGFR基因突变可以筛查对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(epidermalgrowth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)靶向药敏感的患者,从而实现靶向个体化治疗。
  但是临床上常由于多种原因,如肺癌病理组织标本过少、患者病情过重无法耐受获取组织标本的相关检查,创伤大,操作繁琐等,导致无法进行组织学EGFR 突变检测,从而缺乏使用EGFR-TKIs治疗的依据。近年来,NSCLC患者的外周血循环DNA分析可一定程度反映肿瘤情况,其检测得到了广泛关注。研究发现肿瘤患者外周血肿瘤DNA含量明显高于正常人群,且外周血肿瘤DNA 与肿瘤组织DNA 具有类似的遗传学特性,有数据显示血液EGFR水平与组织样本的一致性为60%~95%。杨长绍等对云南地区NSCLC患者组织标本的EGFR基因突变进行了检测,发现了具有显著的地区差异性,本文就云南地区NSCLC患者外周血中的EGFR基因突变情况进行检测分析。
  1    材料和方法
  1.1 临床资料
  本院自2017年10月至2019年7月共收治37例仅有细胞学标本但无组织学标本、仅行外周血EGFR突变检测的Ⅳ期非小细胞肺癌患者。其中男20例,女17例;年龄36~69岁,中位年龄55岁;有吸烟史者20例,无吸烟史者26例;腺癌36例。
  1.2 外周血EGFR检测方法
  1.2.1 标本采集
  常规采血10 ml,用一次性真空采血管(游离DNA保护专用) 接采血针收集血样10 ml,立即轻柔地上下颠倒采血管8~10次,并于4 h内提取游离DNA。
  1.2.2 血浆分离
  全血4000 rpm 离心10 min,取上清(吸取时枪尖离底部残留物2~3 mm),此上清即为血浆(≥2 ml) 。
  1.2.3 DNA提取
  取4 ml血浆样品(不少于3 ml),加入1.8 ml Buffer CDL,再加入50μl蛋白酶K液,充分混匀10 s, 63℃水浴消化15 min。快速冷却至室温,加入400μl DNA Tracer 混匀,再加入3.3ml 预冷的异丙醇,颠倒混匀,10000 rpm 离心5 min,弃上清;往沉淀中加入470μl Buffer CDB 与10μl蛋白酶K液,63℃消化10 min,快速冷却至室温,加入200μl无水乙醇,将沉淀吹打混匀。将沉淀混合液全部转移至吸附柱中,10000 rpm 离心30 s,弃废液。加入700 μl Buffer CW1, 10000 rpm 离心30 s;加入700 μl Buffer CW2, 10000 rpm 离心30 s,;加入700 μl 无水乙醇,10000 rpm 离心30 s,更换收集管, 13000 rpm 离心5 min;将吸附柱转移至干净的1.5 ml离心管中,往吸附膜中心滴加50 μl Buffer CDE,90℃孵育5 min, 13000 rpm 离心1 min,收集样品DNA。
  1.2.4 DNA浓度测定
   用微量紫外分光光度测定DNA 样品的浓度及OD260/OD280值。
  1.2.5 ARMS法进行PCR 扩增
   人EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司。取42.3 μl 样品DNA,加入2.7 μl Taq 酶(EGFR) ,混匀后向每个反应管内加入5μl。将8连排反应条盖上盖子,离心后放入实时定量PCR仪中。每轮反应设置阴阳对照各一。扩增程序: 95℃ 5 min; 95℃25 s, 64℃ 20 s,72℃ 20 s,15 个循环; 93℃ 25 s,60℃ 35 s,72℃ 20 s, 31 个循环,在60℃时收集FAM/VIC 荧光信号。
  1.2.6 结果判定
  阴性对照无信号,阳性对照Ct值<20。待测样品内控、外控信号应升起,外控信号应在13~19。满足上述条件的试验结果为可信结果。突变Ct值≥阴性临界值时为(-),<阳性临界值为强(+)。当突变Ct值≥阳性临界值且<阴性临界值时,计算△Ct值(△Ct 值=突变Ct值-外控Ct值)。若△Ct值<相应的△Ct Cut-off 值,则该样品为弱(+);若△Ct值>相应的△Ct Cut-off值,则该样品为(-)。
  2    结果
  2.1 血浆DNA质量控制
  用微量紫外分光光度仪测定DNA 样品的浓度,平均浓度为11.02 ngμl,平均OD260/OD280 比值为1.96。
  2.2 EGFR基因突变频率与类型
  云南地区37例中血液标本中,14例(37.8%)存在EGFR 基因的突变,其中EGFR基因外显子21 L858R突变率最高,为42.8%(6/14);其次为19 缺失突变(28.6%,4/14);19Del、L858R 占总突变的71.4%(10/14);2例患者(14.3%,2/14)同时出现外显子18 G719X 和外显子20 S761I 双突变, S761I无独立突变,与18外显子G719X伴随存在;2例患者(14.3%,2/14)同时出现外显子20 T790M 和外显子21 L858R 突变;2例患者出现外显子21 L861Q突变(14.3%,2/14)。
 
  3    讨论
  表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶受体抑制剂(tyrosine kinases inhibitors, TKIs)是目前最重要的靶向治疗药物,对于有EGFR敏感突变的NSCLC,采用EGFR-TKIs治疗具有明显的临床疗效。然而,肺癌组织活检样本具有局限性,如很多高龄患者诊断时已无法手术因而无标本可取,气管镜取材小,某些肿瘤解剖位置及肺部基础疾病不适和穿刺,穿刺本身诸多风险,反复取材患者接受程度低等。“液体肿瘤学检测”因其操作可行性强、侵害性小、具有实时动态等特点正越来越受到临床关注。循环肿瘤DNA(ctDNA) 是凋亡和坏死的肿瘤细胞直接释放到外周血中的DNA 片段,并携带肿瘤组织相关信息。朱毅等报道NSCLC 患者外周血EGFR突变与组织中EGFR突变的一致率为92%。研究发现福尔马林固定及石蜡包埋技术对样本DNA 的会产生一定的影响,每个样本肿瘤细胞的数量与形态和取样的位置及大小存在很大关系,加上肿瘤异质性,导致肿瘤病理组织活检可能不能反映整个病灶的完整信息。外周血中的ctDNA 来源于肿瘤原发灶和转移灶坏死凋亡的肿瘤细胞碎片,这就可能可以避免肿瘤组织的遗传异质性而体现整个肿瘤的遗传学特征。研究表明在中国EGFR 基因的突变存在显著的地域差异,台湾地区的EGFR 基因的突变以外显子21 为主,云南和广东地区以外显子19 为主。云南宣威是肺癌高发的地区,其EGFR基因外显子18 G719X、外显子20 S768I突变相对较高。
  本研究检测云南地区37例NSCLC 患者血浆EGFR基因,结果发现EGFR基因突变阳性14例,突变率37.8%,同文献报道相符。本研究结果显示,云南地区NSCLC 患者中,EGFR 基因的突变主要发生在21 号外显子L858R 突变及19 号外显子缺失,与文献报道一致。本研究中20号外显子S761I无独立突变,与18外显子G719X伴随存在,突变率为14.3%,这与杨长绍等人报道的云南宣威地区非小细胞肺癌组织标本中EGFR基因突变结果一致,原因是因为本研究选取的云南地区标本包括了云南宣威地区,只是由于标本量相对较少,进行区域划分意义不大。Jian 等对56 例晚期NSCLC 患者血样本检测EGFR突变的检出率为23.2%,并认为血中检测到的EGFR突变可以用于预测吉非替尼的治疗疗效。Liu等对比了不同方法检测血浆样本与组织样本EGFR 突变的准确性,发现与组织样本相比,血浆的灵敏度67.5%( 27/40),特异性为100%( 46/46)。Kim 等对57 例配对样品的组织和血浆分别进行EGFR突变检测,血浆样本和组织样本EGFR突变状态的一致率87.7%。
  综上所述,应用ARMS方法检测外周血中肿瘤细胞的EGFR基因突变,可以较准确地反映NSCLC患者的EGFR突变情况,而且耗时短,损伤小,标本易得且经济实惠,是值得临床推广。但由于ctDNA的含量非常少,通过外周血检测EGFR突变仍有一定的局限性。虽然一次检测外周血EGFR突变阴性,但不说明实体肿瘤细胞的EGFR突变也是阴性,多次检测中任何一次突变阳性都可以成为临床使用EGFR-TKI的依据。但由于外周血样本存在假阴性的可能,组织标本存在肿瘤异质性等特点,因此,我们建议在送检时应进行多种标本兼顾。
  参考文献
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