肾气丸对老年性痴呆大鼠海马Caspase-3表达的影响

发表时间:2019/1/21   来源:《药物与人》2018年11月   作者:王灵俊 张跃明
[导读] 探讨金匮肾气丸对老年性痴呆大鼠海马区神经元Caspase-3表达的影响。
        摘要:目的:探讨金匮肾气丸对老年性痴呆大鼠海马区神经元Caspase-3表达的影响。方法:采用Aβ25~35注射大鼠单侧海马区建立老年性痴呆大鼠模型,用免疫组化SP法检测各组大鼠海马神经元中Caspase-3的表达水平;在显微镜下用测微尺计数海马CA1、CA2、CA3区内单位面积阳性神经元数目作为阳性细胞密度。结果:(1)模型组大鼠海马CA1、CA2、CA3区Caspase-3的阳性神经细胞密度比正常对照组增加,差异有显著性(P<0.01);(2)中药防治组大鼠海马CA1、CA2、CA3区Caspase-3的阳性神经细胞密度比模型组减低,差异有显著性(P<0.01)。结论:金匮肾气丸对Aβ25~35诱导的老年性痴呆大鼠海马神经元具有一定的保护作用,这种作用可能是通过下调Caspase-3的表达,抑制老年性痴呆大鼠海马神经元凋亡相关。
        关键词:肾气丸,老年性痴呆,大鼠,海马,Caspase-3
        老年性痴呆是一种神经退行性疾病,主要表现为进行性的认知功能障碍和行为损害,是最常见的痴呆类型之一。目前有研究认为淀粉样老年斑(SP)、神经纤维缠结(NFT)和神经元丢失是本病重要的病理诊断依据[1]。海马是大脑边缘系统的一部分,与学习记忆功能有密切联系,已有临床病例报告和神经影像学也证实了海马参与陈述性记忆的过程[2]。本实验采用β-淀粉样蛋白(Aβ25~35)注射单侧海马建立老年性痴呆大鼠模型的方法,老年性痴呆的发病机制和治疗研究,提供基础性实验依据。
        1.材料与方法
        1.1实验动物
        清洁级健康成年雄性SD大鼠21只,体重300±20g,饲养环境室温控制在15-25℃,保持空气流通。
        1.2药物及试剂
        肾气丸方(干地黄24g,山茱萸12g,山药12g,牡丹皮9g,泽泻9g,茯苓9g,桂枝12g,附子12g)购于浙江省中医院中药房,煎成含生药1.5g/ml药液,放入无菌容器中4℃保存备用。Aβ25-35购自北京博奥森生物技术有限公司,一抗Caspase-3即用型SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自上海长岛生物技术有限公司。
        1.3实验方法
        (1)分组与造模
        21只大鼠随机分为三组:正常对照组、模型组、中药防治组。平衡饲料,自由进水,喂养1周。

大鼠用2%的戊巴比妥钠(45mg/kg)麻醉后,将大鼠固定在脑立体定位仪上,精确定位右侧海马CA2区(前囟后4.2mm,右侧2mm,深2.6mm),头顶备皮,切开皮肤,在颅骨上用牙钻打孔至海马区注射点,用10μl微量注射器一次性注入2μl凝聚态的Aβ25~35(1mg的Aβ25~35用无菌生理盐水溶解,-20℃保存,实验前将Aβ25~35溶液在37℃保温箱中放置7d以形成聚集态的Aβ25~35),5min内注完,留针3min以保证溶液充分弥散后缓慢撤针。正常对照组在海马内注射同等剂量的生理盐水。
        (2)给药时间和方法
        中药防治组大鼠给药量依据不同种类动物之间药物剂量换算法为依据,按成人(60kg计算)每日每公斤体重药量的6倍计算,剂量约为9.9g/kg生药 /4]。中药防治组在造模前15天开始至成模后4周每天以9.9g/kg的生药量灌胃,每日一次。正常对照组和模型组在造模后给予等量的生理盐水灌胃。
        (3)指标检测
        用免疫组化SP方法,按试剂盒说明进行Caspase-3免疫组化染色。显微镜下观察海马Caspase-3阳性神经细胞形态,用显微镜测微尺计数单位面积内(0.01mm2)阳性神经细胞数。
        (4)统计学方法
        P<0.01为差异有显著性。用SPSS16.0软件统计分析,所得数据以均数±标准差( ±S)表示。
        2.实验结果
        用显微镜的显微方格测微尺计数0.01mm2单位面积内的Caspase-3阳性神经细胞数目作为Caspase-3阳性细胞密度,
        3.讨论
        Caspase-3是Caspase家族最重要的蛋白酶,是细胞凋亡中关键的执行分子,也是凋亡发生的标志性酶。Caspase-3作用的发生主要有两条途径①死亡受体途径,死亡受体CD95、DR3、DR4等经接头蛋白介导,活化下游效应酶Caspase-3等诱发死亡反应;②线粒体依赖途径,凋亡因子促使线粒体释放细胞色素C,细胞色素C在凋亡蛋白酶激活因子1介导下活化下游效应酶Caspase-3,切割特定的凋亡底物,诱发细胞凋亡。
        金贵肾气丸治疗组与模型组相比,大鼠海马区Caspase-3阳性神经细胞表达显著性降低,表明金匮肾气丸对Aβ25~35诱导的老年性痴呆大鼠海马神经元可能具有保护作用,该作用的发挥可能是通过下调Caspase-3的表达,进而抑制细胞损伤、凋亡而实现的,但细胞凋亡过程是一复杂调控网络,金匮肾气丸对凋亡过程中其他调控因子有无影响,尚需进一步的研究。
        参考文献:
        [1] 田金洲,时晶.阿尔茨海默病:一个全新的临床病理单元[J].中国老年学杂志,2008,28 (19):34-37.
        [2] 章元沛.药理学实验[M].北京:人民卫生出版社,1996.238.

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