基于毒性评价的甘遂毒性成分的分离

发表时间:2019/1/11   来源:《心理医生》2018年36期   作者:邢瑶 马国平
[导读] 而化合物prostratin属于二萜类成分,再结合前期的文献研究[3],本论文认为甘遂致腹泻的毒性作用可能与它的二萜类成分相关。

(江苏省中医院  江苏南京  210001)
  【摘要】目的:筛选甘遂的毒性部位,分离、纯化甘遂毒性成分,并进行结构解析,研究甘遂毒性物质基础。方法:95%乙醇回流提取甘遂,回收乙醇后,用石油醚萃取,采用硅胶柱层析法将石油醚部位分成不同极性段,以MTT法测定甘遂各部位对巨噬细胞的增殖抑制作用,确定甘遂石油醚部位中毒性最强的分离段,采用硅胶柱层析法,对毒性极性段进行分离,再结合薄层制备及过凝胶柱Sephadex LH-20的方法进一步的分离纯化,获得毒性成分。毒性成分采用MTT法及刺激巨噬细胞释放炎症因子法考察其毒性大小。结果:从甘遂石油醚部位中共分离得到4个化合物,分别为n-tetratriacont-20,23-dienoic acid(1)、Trilinolein(2)、prostratin(3)、β-sitosterol(4),其中化合物3有较强的细胞增殖抑制作用,其IC50为12μM。结论:甘遂的毒性可能与其含有的二萜类成分相关,毒性机制可能与其诱导肠道炎症反应发生相关。
  【关键词】甘遂;毒性成分;二萜
  【中图分类号】R284                    【文献标识码】A                     【文章编号】1007-8231(2018)36-0320-02
  甘遂为大戟科大戟属植物甘遂Euphorbia kansui的干燥块根。其性寒味苦,有毒,始载于《神农本草经》,具有泄水逐饮、消肿散结的功效[1]。但其药性峻猛,生用易伤人正气,目前,甘遂的毒性成分及毒性机制尚不明确,文献多报道多集中于其二萜类成分。该类成分属于低极性、小分子类化合物,主要存在于极性较低的石油醚部位,故本研究对甘遂的石油醚部位进行系统分离,通过采用多种细胞毒性评价模型来追踪并分离、纯化甘遂中的毒性成分,并对毒性成分进行结构解析,以期阐明甘遂的毒性物质基础,初步解释其毒性作用机制。
  1.实验材料
  1.1 药材
  甘遂采自安徽亳州药材市场,产地河南,药材经江苏省食品药品检验所胡皓彬老师鉴定,为大戟科植物甘遂Euphorbia kansui.的干燥根。
  1.2 仪器与试剂
  德国 Bruker DRX-400 核磁共振仪;FW80-I高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);BOS HYPERSIL C18(250mm×4.6mm,5μm);KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);BP211D电子天平(德国Sartorius公司);UNIQUE-S15型RO-DI实验室纯水系统(锐思捷科学仪器有限公司)。旋转蒸发仪(BUCH Rotavapor R-210),HH-2K 4二列四孔智能水浴锅(南京科尔仪器设备有限公司),酶标仪(美国Bio-rad公司),电热板。
  柱层析硅胶(100-200目,青岛海洋化工厂分厂,批号:0120367);薄层层析硅胶(GF254,青岛海洋化工有限公司,批号:0150235);硅胶板(GF254,青岛海洋化工厂分厂,批号:20160422);凝胶 Sephadex LH-20(Amersham Biosciences);改良型RPMI 1640(Thermo,批号:NZM1579);PBS磷酸盐缓冲液(Thermo,批号:NAC1351);胎牛血清(WISENT);二甲基亚砜(南京化学试剂有限公司,批号:1504036200);青链霉素混合液(无锡海硕生物有限公司,批号:05217862);所用试剂均为分析纯。
  1.3 实验动物
  ICR小鼠,雄性,体重(20±2)g,由上海杰思捷实验动物有限公司提供,动物合格证号2010002607085。
  2.甘遂毒性成分的提取分离
  2.1 甘遂不同极性部位的提取
  称取甘遂饮片10kg,粉碎成粗粉,以8倍量95%乙醇回流提取3次,每次2h,合并提取液,减压回收溶剂,干燥得浸膏867g。取浸膏600g,加水(1:8)混悬后用石油醚萃取,最终得到石油醚部位214.2g,得率3.1%。
  取石油醚部位182.3g,湿法装柱200~300目硅胶后,以石油醚-乙酸乙酯洗脱,分为石油醚-乙酸乙酯(15:1)段50.13g、(10:1)段30.1g、(5:1)段28.71g、(1:1)段23.1g、乙酸乙酯段13.2g,以MTT法测定各段对巨噬细胞的增殖抑制作用,筛选毒性部位,结果表1。
  2.2 化合物毒性评价研究
  健康ICR小鼠脱颈椎处死,75%乙醇浸泡消毒3分钟,腹腔注射PBS缓冲液,轻柔地充分按摩腹部,将收集到的腹腔液于1500rpm离心10分钟,沉淀即为富含腹腔巨噬细胞的细胞层。弃去上清,以含10%胎牛血清的RPMI?1640培养液重悬沉淀并调节细胞密度至1*105个/mL,以此密度将细胞接种在96孔板中,每孔100μL,37℃、5% CO2培养2h后,用PBS缓冲液洗三遍,洗去未贴壁的细胞,即为巨噬细胞,采用MTT法评价各极性段的毒性大小。
  2.3 甘遂毒性化合物的分离、纯化
  毒性极性段经过硅胶柱层析后,再采用薄层制备的方法得到较为单一的斑点,最后采用过凝胶柱Sephadex LH-20(二氯甲烷-甲醇1:1、甲醇)的方法进行纯化,从石油醚-乙酸乙酯(1:1)段得到化合物1(10mg)、2(23mg)、3(20mg),从石油醚-乙酸乙酯(5:1)段得到化合物4(20mg)。
  
  表1  甘遂各极性段对对巨噬细胞增殖抑制作用IC50(μg/ml)值
   
  2.4 甘遂毒性成分的结构鉴定
  化合物1:无色针状结晶(二氯甲烷-甲醇):1H-NMR(400MHz,CDCl3)1HNMR(CDCl3);δ7.29(1H,s),5.41(1H,m),5.37(1H,m),5.32(1H,m),5.12(1H,m),2.78(2H,t,J=7.2Hz),2.44(2H,dd,J=7.2Hz,7.8Hz),2.16(2H,m),2.09(2H,m),1.68(2H,m),1.41(16H,brs),1.32(20H,brs),1.28(8H,brs),1.25(4H,brs),0.87(3H,t,J=7.1Hz,);13CNMR(CDCl3):δ178.64(C-1),130.23(C-21),130.03(C-23),128.08(C-20),127.91(C-24),33.88(C-22),31.93(C-21),31.53(C-25),29.68(CH2),29.59(CH2),29.43(CH2),29.35(CH2),29.24(CH2),29.14(CH2),29.07(7×CH2),29.03(6×CH2),27.21(CH2),25.63(CH2),24.68(CH2),24.61(CH2),22.69(CH2),22.57(CH2),14.06(Me-34)。上数据与文献[2]对照一致,故确定为n-tetratriacont-20,23-dienoicacid。
  化合物2:黄色油状物(二氯甲烷-甲醇):13C-NMR(400MHz,CDCl3)δ62.11(glyc-erylCH2),68.09(glycerylCH),173.26(C=Oα),172.84(C=Oβ),31.92(C-2α),34.02(C-2β),24.86(C-3α),24.87(C-3β),29.35(C-4α),29.31(C-4β),29.17(C-5α),29.27(C-5β),29.52(C-6α),29.65(C-6β),29.70(C-7α),29.76(C-7β),29.12(bothC-8),130.00(C-9α),129.98(C-9β),128.05(C-10α),128.07(C-10β),25.62(bothC-11),127.88(C-12α),127.87(C-12β),130.22(bothC-13),27.20(bothC-14),29.36(bothC-15),31.52(bothC-16),22.56(bothC-17),14.06(bothC-18)。上数据与文献[3]对照一致,故确定为Trilinolein。
  化合物3:白色粉末(二氯甲烷-甲醇):1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:d7.54(s,1H),5.69(d,1H,J=4.8Hz),4.03(d,1H,J=12.6Hz),3.96(d,1H,J=12.5Hz),3.27(brs,1H),3.00(t,1H,J=5.4Hz),2.52(d,1H,J=18.6Hz,),2.46(d,1H,J=18.6Hz,),2.08(dd,1H,J=7.1Hz,14.5Hz,),2.06(s,3H,OCOCH3),1.95~1.99(m,1H),1.77(dd,3H,J=2.3Hz,3.8Hz),1.56(dd,1H,J=11.3Hz,14.6Hz),1.19(s,3H),1.06(s,3H),0.88(d,3H,6.4Hz,),0.84(d,1H,J=5.3Hz,)13CNMR(CDCl3)δ:208.90(C-3),173.30(-COCH3),161.18(C-1),139.87(C-6),132.85(C-2),130.26(C-7),75.98(C-9),73.79(C-4),68.29(C-20),63.63(C-13),55.80(C-10),39.18(C-8),38.69(C-5),36.29(C-11),32.44(C-14),31.83(C-12),23.23(C-15),21.24(-COCH3),18.55(C-18),15.33(C-17),10.10(C-19)。上数据与文献[4]对照一致,故确定为prostratin(酪氨酸激酶抑制剂)。
  化合物4:无色针状结晶(石油醚-乙酸乙酯):13CNMR(DMSO)δ:11.85,11.98,18.78,19.04,19.38,19.79,21.09,23.10,24.30,26.16,28.23,29.21,31.68,31.92,33.98,36.14,36.51,37.27,39.80,42.32,42.34,45.88,50.17,56.10,56.79,71.81,121.69,140.78。上数据与文献[5]对照一致,故确定为β-sitosterol(β-谷甾醇)。
  3.小结
  腹痛腹泻及严重的胃肠道刺激是误食甘遂临床最常见的中毒症状,研究表明,腹痛腹泻的发病机制有四种[6]:①肠腔内渗透压增加;②肠腔内水和电解质的过度分泌;③肠蠕动加速;④炎症所致的病理渗出物大量渗出。巨噬细胞作为一种重要的免疫细胞,可以通过吞噬及降解被抗体标记过的外来粒子而发挥先天免疫作用。它的激活能够产生细胞因子,这些细胞因子会对肠道粘膜造成破坏,造成腹痛腹泻的反应[2]。
  本文从甘遂干燥根的石油醚萃取部位分离得到4个化合物。并测试了其中三种化合物对巨噬细胞的增殖抑制作用,研究发现化合物prostratin具有较强的抑制作用,而化合物prostratin属于二萜类成分,再结合前期的文献研究[3],本论文认为甘遂致腹泻的毒性作用可能与它的二萜类成分相关。
  
  【参考文献】
  [1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(2010年版一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:195-196.
  [2]李玉林.病理学[M].人民卫生出版社,2010.
  [3] Evans, FJ, and Taylor, SE. Pro-inflammatory, tumour- promoting and anti-tumour diterpenes of the plant families Euphorbiaceae and Thymelaeaceae, In:Herz W ed, Progress in the Chemistry of. Organic Natural Product, 1983,44. 1-99.

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