PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌L型rpsL耐药基因

发表时间:2017/12/18   来源:《心理医生》2017年33期   作者:张霞
[导读] 结核病是危害人类生命健康的传染病,给患者带来了严重的身心伤害,尤其是耐药结核病。

(太原市第四人民医院  山西太原  030053)
  【摘要】目的:探讨耐药基因突变以及L型耐利福平的关系。方法:对2015年8月到2016年8月期间,在我院收治的96例肺结核患者进行研究。采用PCR-SSCP法,对50株MTL型临床分离株进行测试。同时,进行常规的药敏实验。然后,对比检测的结果。结果:在96例肺结核标本中,有54份被检出为MTL型,占56.3%,包括42例人型结核分支杆菌,12例牛型结核分支杆菌。在药敏试验中,将50株MTL型临床分离株作为研究对象。其中,有24株敏感,耐药率为52%。通过PCR-SSCP分析中,显示21例为阳性,检出率为42%。在恢复试验中,显示21株rpsL基因突变株中,15株依然对利福平有耐药性,占到71.4%。29株rpsL基因阴性株中,有26株恢复为细菌性,占到89.7%。结论:对50株MTL型临床分离株进行测试后,有24株对利福平产生耐药性,占52%。21株显示阳性,检出率为42%。根据药敏结果,以及PCR-SSCP法,得出的两种办法的符合率为80.9%。
  【关键词】结核分支杆菌L型;rpsL;耐药基因;PCR-SSCP;检测;分析
  【中图分类号】R450                    【文献标识码】A                     【文章编号】1007-8231(2017)33-0180-02
  结核病是危害人类生命健康的传染病,给患者带来了严重的身心伤害,尤其是耐药结核病。利福平作为杀菌药物,成为抗结核化疗方案之一。然而,受到耐药株、结核分支杆菌的影响,降低了治疗效果,结核病的治疗带来了很大障碍[1]。因此,医生必须引起重视,并采取有效的措施,以此来提高治疗效果。本文的目的在于探讨耐药基因突变以及L型耐利福平的关系。对我院在2015年8月到2016年8月期间,收集的的96份痰标本进行研究,采用PCR-SSCP法,对50株MTL型临床分离株进行测试。现报告如下。 
  1.资料与方法
  1.1 一般资料
  对2015年8月到2016年8月期间,在我院收治的96例肺结核患者进行研究。分析患者的痰标本,总计96份。患者的年龄在34岁到68岁之间。其中,男性85份,女性11份。本次研究所用的MT质控菌株为H37Rv。该菌株是由当地的卫生鉴定部门提供的。现报告如下。 
  1.2 方法
  1.2.1 准备试剂  准备好试验需要的试剂。包括:利福平、MTL型液体培养基(92-3TB-L液体培养基)、细菌型普通液体培养基(92-3-TB液体培养基)。以上试剂均从当地的微生物研究院采集。其中,利福平试剂的产地在美国,由BD公司生产。
  1.2.2引物设计  根据MT染色体DNA重复保守序列,设计引物。重复序列为:IS6110(GenbankL08011)。碱基序列:上游为:5'-ACACCACCACTCCGAAGAAG-3'。下游为:5'-TGCGTATCCAGCGAACCG-3'。生产地:上海。产物大小为:201bp。
  1.2.3鉴定结核分支杆菌L型  采用无菌操作,鉴定结核分支杆菌的L型。首先,提取2~3ml晨痰。然后,加入酚红指示剂(0.1~0.2ml),氢氧化钠(2~3倍)。经滴管吹吸后,将其混合均匀。保持温度为37℃,进行水浴消化。待15分钟后,取出适量沉淀物,放入到TB-L液体培养基中接种。均匀混合后,依然将温度设置在37℃。培养时间为1~3周。接种第三天后,密切观察培养基的生长现象。MTL型多为沉淀型生长。提取沉淀物涂片后,采取改良IK抗酸染色法镜检。[2]取出改良IK抗酸染色阳性的MTL型液体培养沉淀物,剂量为0.1ml。


然后,将其接种到两种培养基中,分别是PNB-MTB-L、TCH-MTB-L。温度保持在37℃。接种第三天后,密切观察,一周观察3次。针对阴性的,要求观察到第四周。针对硝基苯甲酸来说,均可抑制牛型与人型MT生长。同时,在抑制MT生长中,也可以单独使用噻吩-2羧酸肼。然而,针对非结合分支杆菌来说,则不被抑制。
  1.2.4常规药敏试验  在常规药敏试验中,应用绝对浓度间接法。待成功接种后,保持温度为37℃。培养时间为1~3周。培养第三天起,密切观察培养基的生长情况,查看底部有无生长情况。平均一周时间,观察3次。然后,取出沉淀物涂片,采用改良IK抗酸染色法镜检。如果结果显示阴性,则要观察到第四周。
  1.2.5结核分支杆菌L型恢复试验  根据相关参考资料,实施结核分支杆菌L型恢复试验。首先,对MTL型菌液进行接种,然后进行培养。将MTL型菌液与92-3TB液体均匀混合后,放置到37℃的环境中。培养时间为1~3周。接种后第三天起,一周观察3次。然后,取出沉淀物涂片,采用IK抗酸染色法进行镜检。如果显示阴性,则观察到第四周。
  1.2.6制备DNA  对标本进行灭火处理,提出DNA后,再进行制备。最后,实施PCR扩增,并分析DNA单链构象多态性分析。
  1.2.7扩增PCR  根据当地生物研究所中的25μ反应体系,扩增PCR。然后,提取12-15μ扩增液。将其均匀混入到电泳加样液中,进行密切观察。如果出现黄色条带,那么被试验的结核分支杆菌L型则呈阳性。
  1.2.8 DNA单链构象多态性分析  从临床分离株、标准株中,分别提取出PCR扩增产物10μ1。然后,按照相同的体积,将其混合到甲酰胺变性液中。温度为95摄氏度。变性5分钟,水浴2分钟。此时,在样品中加入非变性聚丙烯酰胺凝胶,剂量为100g/L。按照试验的要求,温度为15℃以下,400V电泳,待12小时后,取出胶板。最后,采取银染法染色,密切观察结果。PCR产物变性后,呈现为两条单链,电泳后为两条单链带。当单链位置与标准株H37Rv单链位置出现差异时,就是运动变位。根据以上变化,可以对基因的突变做出准确的判断。
  1.3 统计学方法 
  将上述统计数据录入到SPSS 19.0统计学软件中,其中计数资料采取率(%)表示,组间率对比采取χ2检验或t检验;对比以P<0.05表示结果差异明显,具有统计学意义。
  2.结果
  2.1 结核分支杆菌
  在96例肺结核标本中,有54份被检出为MTL型,占56.3%,包括42例人型结核分支杆菌,12例牛型结核分支杆菌。
  2.2 药敏实验结果
  在药敏试验中,将50株MTL型临床分离株作为研究对象。其中,有24株敏感,耐药率为52%。
  2.3 PCR-SSCP分析
  rpsL基因的扩增产物为201bp片段。另外,将标准株H37Rv的rpsL基因扩增物作为对比,进行PCR-SSCP分析。结果显示,21例为阳性,检出率为42%。
  2.4 基因突变与耐药性关系
  对比PCR-SSCP分析与药敏试验的结果,二者的符合率为80.8。
  在恢复试验中,显示21株rpsL基因突变株中,15株依然对SM有耐药性,占到71.4%。29株rpsL基因阴性株中,有26株恢复为细菌性,占到89.7%。
  3.讨论
  利福平是现阶段治疗肺结核的主要抗结核化疗方案用药之一。其作用机制为:与依赖于DNA的RNA多聚酶的β亚单位牢固结合,抑制细菌RNA的合成,防止该酶与DNA连接,从而阻断RNA转录过程。耐RFP是由于其作用靶分子RNA聚合酶β亚单位的编码基因rpoB突变所致。专家经过大量的研究工作,得出的结论为:当16sRNA编码基因,或者核糖体蛋白S12编码基因的影响,一旦发生基因突变后,则使MT产生耐药性。此时,rpsL基因上单碱基发生置换。大部分突变点主要在43位密码子上,并有513位或512碱基插入。如果这些碱基发生突变后,就会使其耐药性提高[3]。
   本组研究中,对50例肺结核患者进行研究。这些患者均属于分支杆菌L型感染。其中,有24例患者对利福平产生耐药性。21例患者出现rpsL 基因突变,占42%。与MT细菌性检出率相比,稍微比较高,但是并不突出。经分析,其主要原因为:由于rpsL发生基因突变后,导致MTL型耐药利福平。除此之外,当rpsL的基因突变株恢复后,依然对利福平具有耐药性。主要原因在于:细胞壁处于缺失状态时,形成了结核杆菌的耐药性。一旦这些缺失的细胞壁被修复后,那些不稳定的L型则重新恢复了对利福平的敏感性[4]。一般情况下,利福平耐药后的稳定性较强,且利福平耐药试验结果可靠性较高。对于临床用药有指导价值,以便于医生及时调整抗结核治疗方案,提高抗结核治疗疗效。
  综上所述,对50株MTL型临床分离株进行测试后,有24株耐对利福平产生耐药性,占52%。21株显示阳性,检出率为42%。根据药敏结果,以及PCR-SSCP法,得出的两种办法的符合率为80.9%。
  
  【参考文献】
  [1]邱媛,陶峰,孙爱华.PCR-SSCP检测结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变[J].中国微生态学杂志,2013,15(05):571-573+576.
  [2]李栋梁,侯瑞生,王侃,李辉,杨红毅,高三友.PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐药基因突变分析[J].中国卫生检验杂志,2014,30(21):3127-3128.
  [3]程晓东,于文彬,苏明权,等.多重聚合酶链反应检测结核菌耐异烟肼相关基因[J].第四军医大学学报, 2013,24(9):849-851.
  [4]吴雪琼,钟敏,张俊仙,等.PCR直接测序法分析结核分枝杆菌katG基因突变[J].临床检验杂志,2014,18(01): 9-11.
  

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