血小板microRNA与糖尿病相关缺血性脑卒中的关系

发表时间:2017/9/18   来源:《航空军医》2017年第14期   作者:段晓梅 夏健
[导读] 高糖可能通过下调miR-223的表达,进而上调PLT活化相关靶基因表达,从而促进动脉粥样硬化及动脉血栓形成,增加IS的发病风险。

(湖南省南华大学附属第一医院  421001)
摘要:目的 明确血小板miR-223在伴糖尿病(DM)的缺血性脑卒中(IS)患者中的表达情况及在血小板(PLT)活化中的作用。方法 通过病例对照研究,收集三组病例组病例(单纯DM7例、不伴DM的IS组6例、伴DM的IS组6例)及性别年龄相匹配的正常对照组8例,空腹抽取静脉血,分离和收集PLT;运用流式细胞术测定各组标本PLT活化率,比较各组间PLT活化率差别;提取血小板RNA,实时荧光定量PCR测定各组PLTmiR-223表达量,分别比较各组PLTmiR-223表达是否存在差异。结果 与正常对照组相比,三个病例组PLT活化率均明显增高,具有统计学意义(P<0.05);与正常对照组相比较,伴DM的IS组和单纯DM组中PLTmiR-223表达均明显下调,具有统计学意义(P<0.05);结论 高糖可能通过下调miR-223的表达,进而上调PLT活化相关靶基因表达,从而促进动脉粥样硬化及动脉血栓形成,增加IS的发病风险。
关键词:缺血性脑卒中;糖尿病;血小板;microRNA

        1.前言
        IS具有高发病率、高致残率、高死亡率以及高复发率等特点,严重威胁人类生命健康。PLT活化和多种原因引起的血管病变之间可相互促进,共同参与动脉粥样硬化和IS的发生发展。DM是目前IS重要危险因素之一。DM状态下的高血糖、胰岛素缺乏或抵抗、代谢异常、PLT内钙离子内环境紊乱以及氧化应激等使DM患者PLT处于明显活化状态[1]。血小板表面的G蛋白偶联受体P2Y12受体在ADP诱导的PLT不可逆聚集和血栓素A2产生中起至关重要的作用。DM患者血小板P2Y12受体表达显著升高,甚至引起P2Y12拮抗剂氯吡格雷和阿司匹林双重抗PLT药物抵抗。微小RNA是一类非编码RNA,能通过碱基匹配原则识别靶基因mRNA3’非翻译区(3’UTR)靶序列,从而降解靶基因mRNA和(或)抑制翻译,在转录后水平调控特定基因表达,对生物体基因的表达起精细调节作用。最近有研究发现无核血小板中也表达多种miRNAs并可调节PLT的功能,其中miR-223在血小板中含量最为丰富,并通过报告基因实验验证了P2Y12是其靶基因,它表达的蛋白参与血小板激活。Zampetaki等人研究发现,观察人群由健康状态发展为DM过程中血浆miR-223的水平显著低于发病前,而高糖处理巨核细胞后细胞内miR-223表达也显著下调[2]。因此,我们推测糖尿病状态或高糖可通过调控PLTmiR-223的表达,从而影响与PLT功能相关靶基因表达,加速动脉粥样硬化、促进动脉血栓形成,增加IS的发病风险。
        2.实验方法
        2.1标本收集
        收集中南大学湘雅医院2011年12月-2012年2月单纯DM7例、伴DM的IS6例、不伴DM的IS患者6例,均为男性患者,未服用抗PLT聚集药物及降糖药物,在取得患者或患者家属知情同意后,收集患者外周静脉血(空腹),其中一管使用CTAD抗凝管收集2ml全血,用于检测PLT活化率;另外使用ACD抗凝管收集14ml全血,用于提取PLT-RNA;并记录患者一般情况、身高、体重、血压、吸烟和饮酒情况,记录患者脑卒中、冠心病、高血压、DM、肝肾疾病等疾病病史和家族史,记录血糖血脂、凝血功能和肝肾功能等生化指标及相关影像学资料。DM诊断标准采用2011年最新美国DM诊断标准;IS根据TOAST病因分型收集大动脉粥样硬化型。收集性别、年龄、民族与上述IS及DM患者相匹配的健康对照人群血液标本8例,且未服用抗PLT聚集药物,收集患者的社会人口学资料、临床生化指标。
        2.2PLT活性测定
        将2ml外周血CTAD抗凝管轻轻振荡混匀,分别取混匀后的全血5μl置于1.5mlEP管内,记为A、B两管。将CD41-FITC和CD62p-PE荧关单抗各20μl加入A管与其内的全血混合;将CD41-FITC和IgG-FITC同型对照各20μl加入B管与其内的全血混合(以上步骤均在暗室内完成)。A、B两管室温下避光孵育30min后,分别加入PBS缓冲液600μl,于流式细胞仪上检测。
        2.3富PLT血浆制备
        将外周静脉血14ml置于低温冷冻离心机内,22℃1000rpm离心20min,吸取上层血浆;再置于低温冷冻离心机中,22℃2000rpm离心8min,上层血浆即贫PLT血浆,下层含白色沉淀血浆为富PLT血浆。
        2.4免疫磁珠法去除白细胞纯化PLT
        富PLT血浆中依次加入3mlautoMACS Running Buffer缓冲液和70μlCD45标记的磁珠,上下混匀,置于DR-MIX数字翻转摇匀仪上,25℃20rpm温育60min。将分选柱置于分选器的磁场区内,将被CD45磁珠标记过的PRP缓缓注入分选柱,收集漏出液,如上重复2次,收集的漏出液即为去除白细胞的纯化PLT。再将漏出液以22℃2000rpm离心8min,弃去上清,所得沉淀为纯化的PLT。
        2.5总RNA的提取
        纯化的PLT总RNA提取使用美国Invitrogen公司的TRIzol提取液提取,依照其说明书提取;实时荧光定量PCR时使用cel-miR-39作为外参。总RNA提取前,分别在200μlPPP和LDP中依次加入1mlTRIzol提取液和5μlcel-miR-39外参,轻轻上下颠倒混匀,室温下静置5min。
        2.6逆转录和实时荧光定量PCR
        按照美国ABI逆转录试剂盒合成步骤在Bio-rad S1000PCR仪逆转录上合成miRNAcDNA;使用ABI TaqMan GEx Master Mix,根据说明书步骤在ABI Step plus One qRT-PCR仪扩增通过实时荧光定量PCR—TaqMan探针法检测miR-223表达量。采用ΔΔCT法分析数据,每个标本重复三次。
        2.7实验数据分析
        应用软件SPSS18.0对数据进行统计学分析。病例组和对照组的临床计量资料用x±SD表示,计量资料组间比较采用多个样本均数间的多重比较—最小显著差异t检验(LSD-t检验);计数资料用百分比表示,各组间比较使用χ2检验。实时荧关定量PCR数据分析采用ΔΔCT法,即ΔCT=CT目的基因–CT内参基因;ΔΔCT=ΔCT处理样本-ΔCT对照样本;倍数变化(RQ值)=2-ΔΔCT。病例和对照组miR-223表达量及PLT活化率比较采用多个样本均数间的多重比较—LSD-t检验;血小板miRNA表达量(CT值)比较采用两样本t检验。
        3.结果
        3.1 病例组和对照组一般情况比较
        本研究共收集单纯DM患者7例、不伴DM的IS患者6例、伴DM的IS患者6例,性别、年龄相匹配的正常对照组标本8例,均为男性。单纯DM组、不伴DM的IS组和伴DM的IS组收缩压均高于对照组,具有统计学意义(P值分别为0.022、0.012和0.040);DM组和伴DM的IS组中空腹血糖均显著高于对照组和不伴DM的IS组(P<0.001);病例组和对照组在年龄、舒张压、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白、吸烟及饮酒史分布上无显著性差异(P>0.05)。
        3.2 PLT活化率的比较
        正常对照组、不伴DM的IS组、伴DM的IS组和单纯DM组PLT活化率分别为12.82%±1.141、16.49%±1.055、19.63%±0.942和15.56%±1.365;与正常对照组相比,三个病例组PLT活化率均增高,具有统计学意义(不伴DM的IS组P=0.002;伴DM的IS组P<0.001;单纯DM组P=0.008);伴DM的IS组分别与不伴DM的IS组和单纯DM组相比较,其PLT活化率均增高,具有统计学意义(P=0.008;P=0.001);不伴DM的IS组和单纯DM组相比较,两组的PLT活化率无显著性差异(P=0.321)。
        3.3各组PLTmiR-223的表达
        与正常对照组相比,伴DM的IS组和单纯DM组的PLTmiR-223表达下调,具有统计学意义(伴DM的IS组P=0.047;单纯DM组P=0.017);不伴DM的IS组与正常对照组相比,PLTmiR-223表达有下降趋势,但无显著性差异(P=0.302);三个病例组间(不伴DM的IS组、伴DM的IS组、单纯DM组)PLTmiR-223的表达无显著性差异(P>0.05)(图3-3)。


        4.讨论
        2008年Merkerova等研究发现miR-223不仅表达于中性粒细胞和单核细胞,在PLT中含量也丰富。2010年Landry等[3]2011年Osman、Nagalla等研究发现miR-223在PLT内含量最高,并发现P2Y12受体mRNA3’UTR区存在miR-223靶向识别结合的特异性序列,运用双荧光素酶报告基因试验进行验证,在不同细胞系,P2Y12受体野生型和miR-223重组表达质粒共转染细胞后能抑制靶基因表达,而突变型组不能抑制靶基因表达,提示miR-223能作用于P2Y12受体mRNA3’UTR,从而抑制其表达,影响PLT活性。P2Y12受体是PLT膜上二磷酸腺苷受体,含有七个跨膜结构域,对PLT激活聚集及血栓形成起着非常重要的作用。P2Y12受体激活可导致血小板释放α-颗粒和致密颗粒,GMP140顺次表达,GPⅡb/Ⅲa受体活化,以及ADP诱导下的TXA2生成和促凝机制的活化,从而引起PLT的聚集和血栓形成;而抑制P2Y12受体的活性(如氯吡格雷)可有效抑制促PLT活化因素所致动脉血栓的形成。因此我们推测,miR-223表达下调,可通过促进其靶基因P2Y12受体的表达,从而影响PLT活化,参与IS的发生发展。
        本研究发现,病例组PLT活化率较对照组明显增高,其中伴DM的IS患者PLT活化率最高;进一步研究发现与正常对照组相比,伴DM的IS患者和单纯DM患者的PLT及血浆miR-223表达水平均下调。国内外研究表明,DM状态下的高血糖、胰岛素抵抗、炎症反应以及氧化应激等可促使DM患者PLT处于明显活化状态,且DM患者血小板P2Y12受体表达显著升高,甚至引起P2Y12拮抗剂氯吡格雷和阿司匹林双重抗PLT药物抵抗;另外Zampetaki等[2]通过大样本前瞻性研究发现,患者由健康状态发展为DM的过程中其血浆miR-223的水平显著低于发病前,且高糖处理巨核细胞后细胞内miR-223表达也显著下调。以上结论与我们的研究结果一致,因此我们推测DM相关IS患者miR-223下调的可能机制为高血糖状态下miR-223表达下调,可促进其靶基因P2Y12受体的表达,进而促进PLT活化和动脉血栓形成,增加IS的发病风险。
        5.结论
        通过此实验,我们发现PLTmiR-223表达下调可能是PLT活化的重要分子机制,高糖可能通过下调miR-223的表达,进而上调PLT活化相关靶基因表达,从而增加IS的发病风险。本研究提示miR-223可作为新型抗PLT药物作用靶点,为DM相关IS患者的治疗开辟新途径。

参考文献
[1]Ferreiro J L,Gomez-Hospital J A,Angiolillo D J. Platelet abnormalities in diabetes mellitus[J]. Diab Vasc Dis Res,2010,7(4):251-259.
[2]Zampetaki A,Kiechl S,Drozdov I,et al. Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes[J]. Circ Res,2010,107(6):810-817.
[3]Landry P,Plante I,Ouellet D L,et al. Existence of a microRNA pathway in anucleate platelets[J]. Nat Struct Mol Biol,2009,16(9):961-966.
作者简介:段晓梅(1988-),女(汉族),湖南衡阳,南华大学附属第一医院,硕士学位,医师,主要从事神经病学的研究。

 

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