荧光PCR法与细菌培养法检测从业人员沙门菌和志贺菌的对比

发表时间:2017/8/28   来源:《中国蒙医药》2017年第9期   作者:廖金其
[导读] 志贺菌、沙门菌是肠道感染中重要的病原菌,可导致患者出现腹泻、散在性或者集体性的食物中毒以及其他严重的感染疾病。

湘乡市疾病预防控制中心  411100
  【摘  要】目的:对比荧光PCR法与细菌培养法检测从业人员沙门菌和志贺菌的检测效果。方法:随机抽取2015年1月至2017年1月3829例从业人员的肛拭子。分别采用荧光PCR法与细菌培养法进行检测。对比两种方法的检出率以及检测时间。结果:与细菌培养法的检出率(1.28%)比较,荧光PCR法的(1.75%)较高;与细菌培养法的检出时间比较,荧光PCR法的较短,差异显著(P<0.05)。结论:从业人员沙门菌和志贺菌的检测采用荧光PCR法,可以取得了良好的检测结果,检出率更高,值得借鉴和推广。
  【关键词】荧光PCR法;细菌培养法;沙门菌;志贺菌
  志贺菌、沙门菌是肠道感染中重要的病原菌,可导致患者出现腹泻、散在性或者集体性的食物中毒以及其他严重的感染疾病。我国的相关法律明文规定:从事食品行业的工作人员不可携带痢疾病原菌、副伤寒病原菌以及伤寒病原菌,否则将取不到健康证,无法在食品领域中工作。由此可知,准确的诊断对于患者的生命健康以及社会均具有极为重要的意义。据调查显示:荧光PCR法可以显著的提高从业人员沙门菌和志贺菌的检出率,并且检测时间较短[1]。故随机抽取2015年1月至2017年1月3829例从业人员的肛拭子进行深入、有效的研究,总结研究如下:
1资料与方法
  1.1基线资料
  随机抽取2015年1月至2017年1月3829例从业人员的肛拭子。男女比例2412:1417,年龄在21-59岁,平均年龄为(40.09±18.27)岁。所有受检者在检验前均签署了《知情同意书》。排除标准:(1)存在血液疾病的。(2)存在重大感染疾病的。(3)不同意进行此次研究的首检人员。
  1.2 方法
  1.2.1 培养法:将无菌的棉拭子插入患者的肛门3cm处,轻轻的旋转2周后,取出棉拭子,待检。将受检者的肛拭子放入SS增菌液中,将增菌液放置35℃的冰箱中,放置18-24小时。在XLD的平板上挑取疑似志贺菌和沙门菌落接种的血平板、MIU管、克氏双糖铁管,进行初步的分纯培养以及生化鉴定,经过生化鉴定后排出克氏双糖铁管、非沙门菌,将剩余的菌落进行革兰染色、血清学分型、菌种鉴定以及显色平板培养[2]。
  1.2.2 荧光PCR法:采用PCR试剂盒,即志贺菌与沙门菌的双色荧光试剂(生产企业:北京鼎国昌盛生物科技技术有限公司;规格:2500T),BIORAD/伯乐荧光定量PCR仪(生产企业:济南来宝医疗器械有限公司;型号T100)。SS增菌液(生产企业:上海广锐生物科技有限公司;规格:10支/盒)曾菌以后,按照标本每10个人一个组合,每隔组合中滴1滴在无菌离心管中,作为一个混合标本。将其充分的振荡、摇匀,每分钟13000r,离心2分钟,弃去上面的清液,重新进行洗涤,加入核酸抽提液100ul,充分摇匀,在99℃的温度下干浴10分钟,每分钟13000r,离心10分钟,取4ul的上清进行PCR反应。取志贺菌、沙门菌核酸荧光PCR检测液36ul,放置PCR反应管中,取4ul的阴、阳对照品以及样本放入PCR反应管中,盖好反应盖,立刻进行PCR扩增反应。反应参数:37℃下两分钟、94℃下两分钟、93℃下15秒、60℃下60秒,循环40次以后,采集荧光[3]。



  1.3 评价标准
  Ct值小于38(不包括38)表示阳性,Ct值在38-40,需要进行重复检测,重复检测后,如果仍然在38-40,即可判定为阴性[4]。
  1.4统计学方法
  利用Epidata3.0软件录入所有的数据,采用SPSS15.0的统计学软件对本次研究的观察指标进行统计,其中包括计量资料(检测时间),采用t检验;计数资料(检出率),采用平均数n,%表示, 检验,两组间的数据具有明显的差异,即(P<0.05),具备一定的统计学意义。
  2.结果
  2.1 比较两种方法的检出率
  对3829例标本进行了荧光PCR法与细菌培养法检测,荧光PCR法检测出65株沙门菌、2株志贺菌,总检出率为1.75%(67/3829);细菌培养法检测出49株沙门菌、0株志贺菌,总检出率为1.28%(49/3829)。细菌培养法的检出率远低于荧光PCR法的,差异显著(P<0.05),经计算, =8.1962 P<0.01,由此可知,荧光PCR法的灵敏度明显比细菌培养法的高。
  2.2 比较两种方法的检测时间
  细菌培养法检测时间是5-7天,平均检测时间为(6.27±1.16)天。荧光PCR法的检测时间是2-3天,平均检测时间为(2.59±0.93)天。细菌培养法的检测时间远长于荧光PCR法的,差异显著(P<0.05),经计算,t=153.1599 P<0.01。
  3.讨论
  公共场所的工作人员以及从事食品行业的从业人员通常都携带致病菌,导致群众中毒的事件经常发生。因此对于日渐增多的体检人员,如何有效的完整志贺菌与沙门菌的筛查,成为了基层医护人员工作的重点[5]。当前,志贺菌与沙门菌检测常用的方法是传统培养法,这种方法检测周期较长、费时、费力、操作步骤繁多复杂,并且容易受到操作人员操作水平的影响,进而大大降低了其敏感性。同时基层医院从事微生物检验的工作人员工作任务量繁重,容易出现漏检以及误检等现象。
  本组研究数据表明:在检出率方面:荧光PCR法的为1.75%、细菌培养法的为1.28%;在检测时间方面:荧光PCR法的为(6.27±1.16)天、细菌培养法的为(2.59±0.93)天。其原因主要是:?荧光PCR法采用的是核酸扩增技术,具有较高的灵敏度,同时还引用了探针技术,具有较高的特异性[6]。?荧光PCR法在8小时之内既可完整对受检标本的初步筛查,具有操作简单的优点,并且直观。?虽然荧光PCR法可能出现假阳性的结果,这主要与受检人员服用抗生素,导致细菌死亡有着极为密切的关系,但是核酸仍然可以被检出。④PCR检测法中的毒素检测,产生气荚膜梭菌的6种毒素,对于食品中毒时间以及气荚膜梭菌分型具有一定的帮助,尤其是食物中毒人员的粪便标本、环境标本以及食物标本支持统一类型的产气荚膜梭菌时,具有极高的诊断价值。
  综上所述:从业人员沙门菌和志贺菌的检测,采用荧光PCR技术,可以有效的提高检出率,缩短检测时间,值得在临床应用中大力推广和使用。
  参考文献:
  [1]陈玲,魏丽娜,吴步东,等. 荧光PCR技术在从业人员伤寒痢疾快速筛查中的应用[J]. 中国卫生产业,2016,13(5):125-127.
  [2]陈玲,魏丽娜,吴步东,等. 荧光PCR技术在从业人员伤寒痢疾快速筛查中的应用[J]. 中国卫生产业,2016,13(2):104-106.
  [3]马淑贞,周卓晟,石晓路,等. 应用实时荧光PCR法快速检测从业体检人群肠道致病菌结果分析[J]. 热带医学杂志,2013,13(11):1412-1414.
  [4]吴海娟. 实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌结果分析[J]. 现代预防医学,2013,40(12):2323-2325.
  [5]马淑贞,石晓路,林一曼,等. 伤寒、甲、乙、丙型副伤寒沙门菌多重荧光PCR方法的评估及临床应用[J]. 中国医药指南,2013,(22):1-2.
  [6]胡兴娟,沈飚,余辉,等. 多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌[J]. 中国食品卫生杂志,2016,28(4):440-444.

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