超高效液相色谱在药物分析中的应用

发表时间:2015/11/9   来源:《健康世界》2015年16期   作者:张亚明
[导读] 石家庄石药集团 河北 050035 高效液相色谱技术是目前最为活跃的分析方法之一,具有灵敏度高、分离度好的特点,因而被广泛应用于食品工业、药物分析、石油化工等行业。
石家庄石药集团  河北  050035
摘 要:高效液相色谱技术是目前最为活跃的分析方法之一,具有灵敏度高、分离度好的特点,因而被广泛应用于食品工业、药物分析、石油化工等行业。随着工业化进程的进展和科学技术的进步,人们需要一种更好分离度、更短分析时间的新技术来对越来越大量的样本来进行检测分析。在这样的需求下,超高效液相色谱法作为一种新技术应运而生。本文就对药物分析中超高效液相色谱仪的应用展开具体的分析
关键词:超高效液相色谱;药物分析;应用
    Abstract : High performance liquid chromatography (HPLC) technique is the most widely used technology in drug detection.It has high sensitivity, high degree of separation characteristics.It is widely used in food industry,pharmaceutical analysis,petrochemical and other industries.With the development of science and technology ,the demand of new technologies in drug testing is more and more urgent. Under the background,Ultra high performance liquid chromatography (UPLC) method arises ,the article is mainly on analysis of this problem.
    Key words:Ultra high performance liquid chromatography ;drug analysis;application
一、超高效液相色谱仪的简要概述
         超高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中做相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。其主要具有如下几方面的优势:
         1、速度 。超高效液相色谱法(UPLC)采用新型全多孔球形1.7μm反相固定相,该固定相是应用“杂化颗粒技术”(hybrid particle technology,HPT)合成的,并由此制备了高柱效的ACQUITY UPLC色谱柱。这使得在常规高效液相色谱需要30分钟时间的样品分析在超高效液相色谱短短为仅需5分钟,并呈现出色谱柱柱效达20万块/m理论塔板数的超高柱效。 
2、灵敏度 。UPLC色谱柱中使用的是1.7μm固定相,分离获得的色谱峰半蜂宽小于1s,这对检测器的要求是极高的。AQUITY UPLC使用采样速度达40点/s,池体积仅为500nL(约为HPLC池体积的1/20)的新型光导纤维传导流通池,当光束通过光导纤维进入流通池后,利用聚四氟乙烯池壁的全析射特征,不损失光能最,而使检测灵敏度比HPLC增加2~3倍。光源可使用可变波长的紫外光或二极管阵列系统。 
         3、自动化 。对于UPLC的进样系统,常规的手动进样阀和自动进样阀都不能满足系统需求了。在UPLC中为保护色谱柱不受极端高压力波动的影啊,进样过程应当相对无压力波动,进样系统的死体积必须足够小,以降低样品谱带的扩展。 
二、超高效液相色谱在药物分析中的具体应用
         1、化学制剂药物分析的应用。在化学药物成分分析中,经常出现样品含量低,分离难度大,分析时间长等情况,UPLC分离效率高,分析速度快,检测灵敏度高等特点为制剂药物分析提供了强有力的支持。王亚静等采用超高效液相色谱方法建立氨氯地平贝那普利胶囊中两种主要成分的含量测定方法,通过条件摸索,使苯磺酸氨氯地平与盐酸贝那普利得到较好分离,在5.14~51.40μg/mL质量浓度范围内,苯磺酸氨氯地平的含量(以氨氯地平计)与峰面积有良好的线性关系(r=0.9999),在浓度19.92~199.24μg/mL浓度范围内,盐酸贝那普利与峰面积有良好的线性关系(r=0.9999)【1】。张振兴等采用超高效液相色谱方法对水杨酸软膏中水杨酸的含量测定方法进行了研究,在选用231nm检测波长,AgilentZORBAXSB-C18色谱柱时,理论塔板数最高,分离效果最好,建立的方法稳定性、重复性和精密度良好,结果准确、专属性强,为进一步提高水杨酸软膏质量标准提供了数据参考【2】。
         2、中药制剂药物分析的应用。中药制剂由于其成分复杂、目标检测物浓度低,相似物较多,给定量分析带来很大困难,UPLC由于其分离效果好、灵敏度高的特点,在中药制剂有效成分分析方面往往能获得较满意的结果。刘永利等利用超高效液相色谱对藿香正气水中7种有效成分的含量进行同时测定,试验选用AcquityBEHC18色谱柱,以乙腈-0.1%磷酸溶液进行线性梯度洗脱,并分别在249,284,336nm进行监测,结果显示,甘草酸、欧前胡素、异欧前胡素等7种成分在各自线性范围有着良好的线性关系(r>0.9999),且加样回收率均在96.16%~103.4%之间【3】。黎行山等利用UPLC方法建立复方广金钱草颗粒的质量标准,采用超高效液相色谱(UPLC)法对制剂中夏佛塔苷及2,3-乙酰泽泻醇B进行含量测定,测试结果表明夏佛塔苷在1.5625~400μg/mL范围内呈良好的线性关系(r=0.9990);2,3-乙酰泽醇B在25.3~227.7μg/mL范围内呈良好的线性关系(r=0.9998),UPLC方法可作为复方广金钱草颗粒的质量控制方法【4】。
         3、中药材质量分析的应用。中药材的UPLC测定研究也发展得很快,安利贞等用超高效液相色谱(UPLC)法来对拉萨大黄药材中甲基虎杖苷、虎杖苷及曲札茋苷三种成分来进行分离和含量测定。

实验采用ACQUI-TYUPLCBEHC18色谱柱,以乙腈-水进行梯度洗脱,结果表明:甲基虎杖苷在1.02~204μg/mL、虎杖苷在1.0225~204.5μg/mL;曲札茋苷在1~200μg/mL的范围内与峰面积有良好的线性关系。平均回收率分别达到98.36%,101.35%及99.33%。建立的方法可作为拉萨大黄药材的检测方法之一【5】。中药指纹图谱是目前公认的能对中药质量能进行有效控制的手段之一,崔思娇等利用超高效液相色谱法来建立酸枣仁的指纹图谱,实验采用ACQUITYUPLCHSST3(2.1mm×100mm,1.8μm)色谱柱,以乙腈-0.05%磷酸水进行梯度洗脱,标定了17个共有峰,并指认了其中5个主要色谱峰,由此建立了酸枣仁的超高效液相色谱指纹图谱,经验证,14批酸枣仁药材的相似度处于0.947~0.994之间,方法快速高效,可用于酸枣仁的质量评价【6】。
三、超高效液相色谱仪检测器在药物分析中的应用
         1、紫外检测器。紫外检测器是应用最为普遍的一种高效液相色谱检测器,其主要是将待检测样品通过流通池,然后借助流通池对于样品中特定波长的紫外线进行吸收,使透过流通池的光强发生变化,从而得到浓度-时间曲线。该种检测器的检测精密度、灵敏度及线性范围均较好,但是其只适用于那些对紫外线有吸收的样品组分的检测中。在随后出现的一种二极管阵列检测器,可以同时获得待测样品组分的色谱图和每个色谱图组分的吸收光谱,光谱图可以用来定性,色谱图则可以用于定量。此外,该种仪器具有良好的重现性和灵敏度,同时对于药物分析的精密度也较好,效率也较高。
         2、荧光检测器。目前我国所使用的荧光检测器大都是带有流通池的荧光分光光度计。相较于紫外检测器而言,荧光检测器具有更高的检测灵敏度,其检测极限可以达到1×10-10g/mL,是目前我国体内药物分析中一个常用的检测仪器,但是该检测器仅适用于检测那些自身能发出荧光或者衍生物可以发出荧光的物质。例如:以百里酚为对照品,用环己烷来对全血中的丙泊酚进行提取,并用荧光检测器对从全血中提取出的丙泊酚含量进行测定,发现检测的灵敏度比紫外线检测器的灵敏度高出100倍,这对于患者血药浓度的检测具有重要的作用。又如通过利用罗红霉素、甲红霉素和红霉素分子中的羟基同FMOC-CL(9-芴代甲氧苯酰氯)发生反应,结果生成的荧光酯具有显著的荧光性,这样就建立了高效液相色谱-荧光法同时测定罗红霉素、甲红霉素和红霉素的方法。
         3、电化学检测器。电化学检测器是基于电化学原理与高效液相色谱法而建立的一种高灵敏度的检测器(灵敏度可以达到pg水平),色谱柱流出物的响应值可以随着电化学检测器电位的变化而变化。此外,该检测器可以在一定的电位条件下得到不同保留时间内所形成的色谱图。例如:可以通过采用电化学检测器来对金荞麦中的表儿茶素含量进行测定,这样就可以为金荞麦饮片的质量标准的建立提供参考依据。如,通过电化学检测器对大鼠血液中的代谢产物和脑组织进行测定,可以实现对5-羟色胺、高香草酸、多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸、肾上腺素和甲肾上腺素等物质的同时测定,并能够对内标3,4-二羟卞胺进行良好的分离。
         4、蒸发光散射检测器。蒸发光散射检测器最先由澳大利亚研究室开发出来,是90年代的通用药物检测器。该检测器主要是在流动相挥发除去的基础上,利用流动相与其被检测物质之间蒸汽压的相对差异,通过不挥发性组分粒子使激光发生散射,然后借助硅光二极管来对发生散射的信号进行记录,并将其输出,从而得到有关的色谱及数据。该仪器主要的运行过程可以分为雾化、蒸发和检测这三个过程。该检测器的最大特性就是其可以对那些挥发性小于流动相,且不含发色团的化合物进行检测,这样将大大地拓宽其在药物分析中的应用范围,如,对于甘油三酯、氨基酸、维生素、磷脂、高级脂肪酸、高分子化合物以及糖类等的分析与检测。
         5、质谱检测器。质谱检测器在通用性、选择性、灵敏度及化合物的结构信息和分子量的提供等方面具有突出的特性。近些年,随着科学技术的发展,液质联用技术已经逐渐的成为一种常规化、自动化的分析手段,并在许多领域中得到了广泛的应用及普及。LC-MC常用的接口技术有动态快原子轰击、大气压化学电离、电喷雾电离、粒子束、等离子体喷雾及特喷雾等。随着软离子化技术的飞速发展,LC-MS在中药研究中的地位与日俱增,并逐渐成为了其他技术所不能替代的药物分析技术。如通过借助LC-MS来对体内局部麻醉剂罗哌卡因、丙胺卡因、甲哌卡因、布比卡因进行同时测定,实验结果精确度高,方法简便、快捷,非常适合药代动力学的研究。
结束语
         超高效液相色谱法自诞生以来,由于其分离快、进样体积小、溶剂消耗少、分离度高等特点,在许多行业得到了广泛的应用,成功将超高效液相色谱法应用于物质分离及分析的论文呈逐年呈指数级增长,标志着超高效液相色谱法逐渐成为一种重要的快速准确的分析手段。除了常规的物质分析,超高效液相色谱仪还可与质谱仪联用,充分利用UPLC的高分离效率和MS的高灵敏度与定性分析,快速完成大量复杂成分的分离与鉴定。随着药物分析方法的发展,相信UPLC作为一种强有力的分析技术,将会在药物分析领域中发挥越来越重要的作用。
参考文献
[1] 王亚静,邓红,张蜀,黄学峰.超高效液相色谱法测定氨氯地平贝那普利胶囊中两种成分的含量[J].医药导报,2014(04):493-495.
[2]张振兴,孙旭,高媛,陈瑶,孙建华,刘云云,梁辉.超高效液相色谱法测定水杨酸软膏中水杨酸的含量[J].实用医药杂志,2014(27):632-633.
[3] 刘永利,赵振霞,李冬梅 ,冯丽.超高效液相色谱法同时测定藿香正气水中7种成分含量[J].中国药科大学学报,2013.44(3):249-252.
[4] 黎行山 ,班莉, 张慧 ,陈卓瀚 ,钟楚倩, 郭丽冰 ,陈慧 .高复方广金钱草颗粒质量标准研究[J].今日药学,2014,24(12):854-858.
[5] 安利贞 ,陈云建 ,方芳, 杨兆祥.超高效液相色谱法测定拉萨大黄中三种化学成分的含量[J].云南中医学院学报, 2013, 36(1):31-34.
[6]崔思娇 ,罗洁 ,马天成 ,张晨宁, 刘芷 ,毕开顺 ,贾英.酸枣仁的超高效液相色谱指纹图谱[J].中国药学杂志,2013 Vol.48 (7):509-511.
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