王振 钱卫庆 姚年伟 刘易昕 徐磊 何强 尹宏
（南京中医药大学南京中医药大学附属南京中医院；江苏南京210000）
[摘要] 目的：体外培养成骨细胞技术不仅仅在研究其生物学特征及功能方面有重要作用, 而且在研究代谢性骨疾病和重建骨组织方面异常重要。高效便捷的体外培养方法，是开展体外实验研究的基础。方法：采用0.25%胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶联合的二次酶消化法对新生SD大鼠成骨细胞进行原代提取、培养、传代。通过观察成骨细胞的形态、碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红矿化结节染色法鉴定，确定其细胞活性及增殖情况。结果：原代成骨细胞多呈混杂细胞，经过3次传代可获取较纯细胞。成骨细胞呈三角形、梭形、多边形，胞体向外伸展，胞浆丰富，胞核呈卵圆形见，碱性磷酸酶和钙结节染色阳性。结论：通过体外培养成骨细胞，可获取符合体外细胞生物学对细胞的要求。为成骨细胞生物学特征及功能、代谢性骨疾病和重建骨组织方面等研究提供基础。
关键词：成骨细胞、细胞培养、碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红矿化结节染色法
Summary of the experience of osteoblasts culture in vitro in neonatal rats
Wangzhen1, Yin Hong2▲, Qiang Weiqing2▲,Yao Nianwei2,Liu Yi Xin1,Xu Lei1, He Qiang 1
(1.Nanjing University of Chinese Medicine；2.Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine)
[Abstract]
Objective: In vitro culture of osteoblasts plays an important role not only in the study of biological characteristics and functions, but also in the study of metabolic bone diseases and reconstruction of bone tissue. Efficient and convenient in vitro culture method is the basis of in vitro experimental research.Methods: Primary extraction, culture and subculture of osteoblasts from neonatal SD rats were carried out by secondary enzyme digestion with 0.25% trypsin and type II collagenase. By observing the morphology of osteoblasts, alkaline phosphatase (ALP) staining and alizarin red mineralized nodule staining, the cell activity and proliferation were determined.Results: Most of the primary osteoblasts were hybrid cells, and the more pure cells could be obtained after 3 passages. Osteoblasts were triangular, fusiform and polygonal in shape. The body of osteoblasts extended outwards. The cytoplasm of osteoblasts was abundant. The nucleus of osteoblasts was oval. Alkaline phosphatase and calcium nodule were positive.Conclusion: Osteoblasts cultured in vitro can meet the requirements of cell biology in vitro. It provides the basis for the study of osteoblast biological characteristics and functions, metabolic bone diseases and reconstruction of bone tissue.
Key words: osteoblasts, cell culture, ALP staining, alizarin red mineralized nodule staining
成骨细胞是重塑单位的骨形成细胞，对于骨骼的生长和维持至关重要[1]。成骨细胞是源自多能间充质干细胞的单核专用细胞，它们可以通过激活不同的信号转录途径而分化为不同的间充质细胞谱系，例如成骨细胞，软骨细胞，成纤维细胞，成肌细胞和脂肪细胞[2]。细胞代谢已成为对慢性疾病的病理生理学进行基础研究的重点[3]。成骨细胞体外研究以成为探究如何影响代谢性骨疾病的主要方法，成功培养成功细胞是实验的基础，本次研究旨在总结相关经验。
基金项目：江苏省南京市医学科技发展一般性课题（YKK17240；YKK17148)
作者单位：王振（1994-），男，南京中医药大学附属南京中医院2017级中西医结合临床在读研究生；研究方向：骨伤科疾病。 ▲共同通讯作者
1 材料及方法
1.1材料：①动物：新生SD大鼠（24h以内）12只，性别各半。购于南京医科大学。②试剂：DEME（南京恒博生物；批号：8119361）；PBS（南京恒博生物；批号：8119396）；Ⅱ型胶原蛋白酶（南京恒博生物；批号：EZ4567A109）；0.25% 胰蛋白酶(南京恒博生物；批号：2120917)；胎牛血清（南京恒博生物；批号：FBSSA00818-1）;双抗（南京恒博生物；批号：2108966）。③仪器：CO2培养箱（Thermo HRRAce11 150i）；高速低温离心机（美国贝克曼 J-26XP）；超净台（Heal Force）；倒置生物显微镜（奥林巴斯CX41）。
1.2方法
1.2.1成骨提取：①将12只新生SD大鼠浸泡于酒精中至死后取颅骨，将颅骨浸泡于PBS中用手术刀片剔除附着表面组织，PBS冲洗3遍至骨片透明。将骨片于干净培养皿中剪碎为0.5mm×0.5mm×0.5mm，用移液枪加0.25% 胰蛋白酶4ml后置于培育箱中消化10-15min。②取出后吸弃上清液，加入0.1%Ⅱ型胶原蛋白酶5ml于培育箱中消化1h后，270目滤网过滤后取上清液置于离心管中于1000r下离心7min，吸弃上清液（注意不要误吸细胞团）后加入配置好的培养液1ml（450mlDEME+50ml胎牛血清+5ml双抗）充分吹打100下，移液枪辅助下移入装有培养液4ml培养皿，放置培育箱中。③重复步骤②2-3次。
1.2.2成骨细胞培养及传代：将成功细胞培养2d进行换液并放置于显微镜下观察，待细胞贴壁成长至铺满培养皿80%时进行传代。具体步骤：取培养皿吸弃培养液，用PBS冲洗2遍，0.25% 胰蛋白酶4ml充分消化15min后，于显微镜下观察细胞脱壁，形态呈圆形，移液枪吸取上清液于离心管中1000r离心7min后，吸弃上清液（注意不要误吸细胞团）后加入配置好的培养液2ml充分吹打后等份装于2份新培养皿中培养，24 h 后换液。之后传代方法同上。
1.2.3成骨细胞的鉴定：本次选择3代成功细胞进行碱性磷酸酶（ALP）染色以及钙结节染色 来鉴别。具体步骤：取3代成骨细胞接种于装有玻片的6孔板中，待细胞基本铺满玻片时取出，PBS 冲洗，用 95 ％乙醇固定 10 min，具体染色过程详见说明书。
2结果
2.1形态学过程：原代细胞培养2 d，显微镜下观察可见少量成骨细胞，见图1。原代细胞培养约 7 d 后，细胞数增多，向四周充分伸展，呈三角形、梭形、多边形，胞体向外伸展，胞浆丰富，胞核呈卵圆形见，图2、3。约 15 d 起，细胞数目增多，形状如瓦片状重叠生长，细胞多集结于中心生长，中心密集且具体形态难以不清，图 4。
2.2培养过程中出现的问题：出现本次结果在传至第3代后第2d，准备换液时于显微镜下发现，培养皿中出现如“奶”膜一样，形态如同网格状，将膜吹开发现仍有少量成骨细胞贴壁成长，见图5、6。总结经验发现出现此种情况的原因在于培养皿中细胞数目过多而导致分化变形死亡。
2.3染色： ①碱性磷酸酶（ALP）染色：本实验经染色后倒置显微镜下可见阳性细胞胞浆内有灰黑色颗粒，细胞体形态呈不规则形，见图7。②钙结节染色：本实验经染色后倒置显微镜下可见细胞聚集成团呈多中心生长，细胞团中央钙盐沉积形成不透光的矿化结节，且越靠近钙结节中心处染色越深，见图8。
3讨论
骨骼处于恒定的重塑状态，这对于维持正常的骨骼结构和功能很重要[4]。骨稳态取决于破骨细胞对骨的吸收和成骨细胞对骨的形成。破骨细胞负责老化骨骼的吸收，成骨细胞是负责骨骼生成和重塑的间充质来源的细胞，通过产生细胞外基质蛋白来调节骨骼结构和骨基质矿化，并通过产生细胞因子或直接细胞接触来诱导破骨细胞生成[5-6]。在生理条件下，吸收和形成是稳定的。但是，如果平衡失调，骨骼的结构或功能就会异常而发生骨代谢疾病，例如骨质疏松症、骨关节炎[7-11]。
体外培养成骨细胞技术不仅仅在研究其生物学特征及功能方面有重要作用, 而且在研究代谢性骨疾病和重建骨组织方面异常重要[12]。骨质疏松症是老年性常见全身代谢性骨疾病[13], 主要病理学原因为成骨细胞增殖能力降低而破骨细胞吸收能力加快, 因而研究成骨细胞对其治疗具有直接作用[14]。尹宏等[7、9、15、16]得出中药淫羊藿以及雌激素可以显著促进成骨细胞增殖、通过成骨细胞相关基因转录增强其活性、促进骨质疏松骨折的愈合。在骨关节炎中发现了两组不同的成骨细胞，其中低骨关节炎成骨细胞可能参与诱导骨吸收，而高骨关节炎成骨细胞可能参与促进骨形成[2]。骨关节炎的发病机理仍知之甚少，目前尚无修复退化软骨和骨质改变的治疗方法。越来越多的证据强调了成骨细胞在骨关节炎中的重要作用[17]。
体外培养成骨细胞技术在应用于代谢性骨疾病相关领域的体外研究展现出愈发重要的前景[18]。本文描述了原代成骨细胞提取、培养、传代、鉴定及培养过程中遇到的相关问题，希望能为其他研究人员实验过程中带来一定的帮助。
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