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培养条件对活跃链霉菌合成那西肽的影响分析

发表时间：2020/1/8 来源：《科技新时代》2019年11期作者：张小朋曹春华王丁相余有龙吴中华

[导读] 研究活跃链霉菌19号摇瓶发酵合成那西肽的条件．研究结果表明：在实验范围内，种龄、接种量、初始ｐＨ、溶氧和温度对那西肽产量、菌体干重、糖利用率、基于菌体干重得率与基于菌体糖耗得率总体表现先增大后减少的趋势．最后，在种龄40ｈ、接种量5％、初始6.5PH值、溶氧8％、28℃的优化条件下，那西肽产量达到1195mg/L，与原工艺相比较，那西肽的产量增加了29％。

张小朋曹春华王丁相余有龙吴中华
        甘肃汇能生物工程有限公司甘肃省 733000
        摘要：研究活跃链霉菌19号摇瓶发酵合成那西肽的条件．研究结果表明：在实验范围内，种龄、接种量、初始ｐＨ、溶氧和温度对那西肽产量、菌体干重、糖利用率、基于菌体干重得率与基于菌体糖耗得率总体表现先增大后减少的趋势．最后，在种龄40ｈ、接种量5％、初始6.5PH值、溶氧8％、28℃的优化条件下，那西肽产量达到1195mg/L，与原工艺相比较，那西肽的产量增加了29％。
        关键词：活跃链霉菌；那西肽；培养环境


        1引言
        那西肽属于含硫多肽类抗生素类型，又被称之为诺西肽，它是在活跃链霉菌中产生的，当前西方较多的发达国家如日本、美国等都允许将其添加到兽药研发当中，不过我们国家的利用水平比较低，主要在于对其的研究比较少，所以要加强研究，提高利用率。现在低于那西肽的发酵工艺主要是通过培养基和补料办法促进产量提升，有关培养条件给那西肽带来的影响研究还比较少。对此本文基于对活跃链霉菌19#的考察，在600ML的摇瓶中从种龄、溶氧以及温度几方面着手进行干预研究，考察那西肽产量、菌体干重等对培养条件的作用，给相关研究提供一些参考。
        2材料与方法
        2.1菌种来源
        菌种来源于汇能生物公司实验室所保存的活跃链霉菌第19号菌株。
        2.2配置培养基并进行灭菌处理
        斜面培养基：其中含有豆饼粉0.5%，琼脂2.0%，HNO3 0.1%、MgSO47H2O 0.05%等，在高温121摄氏度下静置20分钟；
        种子培养基：葡萄糖3%、玉米浆2%、轻质碳酸钙0.5%等，115摄氏度下静置25分钟；
        发酵培养基：淀粉7%、酵母0.5%、黄豆粉4%、NACL0.4%，115高温下静置处理25分钟。
        2.3进行摇瓶发酵处理
        在固体斜面培养基之上进行活跃链霉菌的接种处理，在培养条件为恒温温度37℃以及PH示值在初始状态7.8条件下培养72小时；从斜面上去除0.5平方厘米的孢子放到装液三角瓶当中，在28℃和每分钟转速280的条件下对其培养30小时，最后接种到发酵培养基当中，和母瓶同样条件培养120小时。
        2.4测定菌丝体的干重量
        将10毫升的发酵液放置在离心管当中，离心 4000RPM 10分钟，抛去上层液，进行三次无菌处理，在65干燥箱当中放置恒重，减去离心管的重量就是菌体干重。
        2.5测定糖分
        使用二硝基水杨酸法进行测定；
        2.6测定氨基氮
        使用甲醛法测量培养基中的可溶性氨基氮；
        2.7测定那西肽产量
        使用分光光度计法。
        3结果
        3.1那西肽产量受到种子质量的影响
        该研究中主要考察了种龄和接种量给菌体生长带来的影响：
        （1）种龄方面。16小时之前的菌体干重变化幅度较低，一般在13.5g/L，在48小时时间段达到最大值，然后逐步降低；从镜检结果可以看出，种子在培养的初始阶段菌丝比较小，并且PH和氨基氮的浓度和还原糖浓度变化不大，在中期培养的菌丝越来越多，培养基中的氨基氮浓度从每升0.96逐渐下降至0.186，还原糖浓度从30降至5g/L。综合数据可知活跃链霉菌19号菌种的对数期在16-48小时阶段之中。选择的不同种龄的种子进行发酵，我们发现那西肽的产量以及其菌体干重和糖分利用率都是先升后降的趋势，种龄在40小时达到最佳，所以由此可以确定最佳种龄为40h。

        表1 种子生长过程曲线
        （2）接种量的影响，实验得出接种量在5%的时候那西肽产量最大920mg/L。然后不断降低，菌体干重变化越来越小，在接种量处于5%的时候糖的利用率最低。
        3.2探究PH初始值的影响
        发酵液中PH的初始值对那西肽的产量影响比较高，在PH达到6.5的时候其产量到达最高位置，后来逐渐随着PH减小而降低，在PH为5.6的时候菌体干重最高，糖的利用率初始6.5时候最高。
        3.3温度的影响
        温度是保证酶的活性的必要条件，对此应该始终将温度控制在合适的范围之中，在温度处于29摄氏度的时候那西肽产量比较高，处于最高位置1194mg/L。菌体的干重随着温度的增加而增加，并且糖分利用率随着温度升高不断升高，处于32摄氏度时候达到最高，后来的实验表明，对变温延长抗生素的生长期进行有效的设计可以提高那西肽的有效产量。
        4讨论
        该研究中通过公司实验室的19号活跃链霉菌作为考察对象，对可能造成那西肽合成影响的诸多影响因素进行了探究分析。研究结果显示，在种龄40h以及PH初始值为5.6左右的时候，菌体干重达到最大值，变化趋势为先增加再减少；不过接种量对于菌体干重的作用效果并不强，所以结合该研究结果我们在今后的实际生产工作当中，可以让菌体在最初发酵期快速增长，以此来缩短其原有生长实践。在种龄为40h以及接种量为5%和初始值在6.5的情况下，那西肽产量为最高，趋势先大后小，在进入下一级代谢产物的积累阶段以后然后通过中间补料改善环境，为菌体合成提供有效环境，获得更高产量的那西肽，糖分利用率增加，种龄40h的时候初始PH值为6、装液量50毫升，摄氏度为32度时候，糖的利用率最大，先大后小；在接种量为数值5%的时候，利用率降低，先减少再增加，种龄40h的时候基于菌体的干重得率和基于菌体糖耗得率也都是最大值，不过在装液量处于60毫升的时候，基于菌体的干重得率达到最大，装液量为40毫升时候达到最大，在20摄氏度下菌体干重最大，32摄氏度时候菌体糖消耗最大，变化趋势都是先增加再降低。
        参考文献：
        [1]夏俊, 薛正莲, 赵世光. 培养条件对活跃链霉菌合成那西肽的影响[J]. 安徽工程大学学报, 2013, 28(1):16-18.
        [2]黄增才. 一种利用活跃链霉菌发酵生产那西肽的方法:.
        [3]莫秋燕, 宋元达. 过表达根瘤血红蛋白基因对活跃链霉菌那西肽产量的影响[J]. 安徽农业科学, 2016, 44(24):157-159.
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        [5]赵世光, 李德才, 薛正莲, et al. 表面活性剂对活跃链霉菌产那西肽发酵的影响[J]. 中国抗生素杂志, 2015(05):22-27+46.