王爱帝1# 徐心悦1# 李鑫运 刘卓然 景秀丽1*
1山东第一医科大学(山东省医学科学院) 生命科学研究中心，山东 泰安 271000
摘要：研究阿司匹林（Aspirin）可否减轻急性过敏性哮喘症状。以 50μg papain诱导正常C57BL/6小鼠诱导急性过敏性哮喘模型，用阿司匹林腹腔注射小鼠，每天用阿司匹林处理小鼠以达到维持阿司匹林持续效果。处理之后 6 天，pbs、papain、papain +aspirin组进行对比，分别比较各组支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺中炎症性细胞：包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的数量变化情况。结果：pbs组嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的数量细胞数量较少；papain组炎症性细胞数量显著增加；而papain +aspirin与阳性对照papain组相比，炎症性细胞数量显著减少。结论：阿司匹林可以减轻炎症，减缓急性过敏性哮喘症状，可能减少哮喘病人对皮质类固醇的依赖。
关键词：急性过敏性哮喘；阿司匹林；嗜酸性粒细胞
哮喘是一种使肥大细胞、树突状细胞等多种炎症细胞激活，淋巴细胞和嗜酸性粒细胞活化并浸润的慢性炎症性疾病，以反复发作的气道阻塞和喘息为特征。流行病学调查显示，全世界有3亿多人患有哮喘，且近几年发病率有持续增长的趋势。哮喘由多种危险因素综合引起，其中吸入污染物和环境过敏原，如花粉、动物皮屑和室内尘螨，被认为是哮喘发病的主要原因。现在，多以长效β２受体激动剂和糖皮质激素为主的药物作为一线治疗方案，使大多数轻中度哮喘患者病情得到一定有效控制，然而临床上仍然有接近10％～20％的哮喘患者难以治愈，经过规治疗后病情仍然难以控制。最近有研究表明，阿司匹林可用于缓解慢性支气管哮喘。但是，阿司匹林能否影响急性过敏性哮喘的症状，尚未报道。本研究通过观察支气管肺泡灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和肺组织炎症性细胞，包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的数量变化情况，分析阿司匹林对急性过敏性哮喘小鼠炎症的影响,为探讨阿司匹林治疗哮喘的作用机制打坚定基础，为治疗过敏性哮喘提供的新方法。
1.材料和方法
1.1 材料
正常C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，aspirin和papain购自Sigma公司。
1.2 动物免疫和处理
将18只C57BL/6小鼠随机分为3组，pbs组、papain组、papain +aspirin组。papain组和papain +aspirin组用50μg过敏原papain连续滴鼻免疫3天（day0、day1、day2），免疫的同时腹腔注射aspirin (200mg/kg/天)，诱导正常C57BL/6小鼠急性过敏性哮喘模型。免疫后第6天（day5）处死，分析检测各处理组滴鼻免疫后day5时肺及BALF中炎症性细胞，包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的数量变化情况。
1.3 方法
1.3.1 BALF中炎症性细胞变化分析
BALF收集及细胞分类计数。免疫后第6天时眼球采血，通过气管插管行支气管肺泡灌洗，分3次缓慢注入 PBS液，分别为0.7 mL、0.7 mL和0.6 mL，缓慢收集，回收率约为 80%。收集的细胞溶液，2500 r/min 离心, 5min，收集上清液 -20 ℃保存待测。沉淀用 0.2 mL PBS 重悬，并采用血细胞计数板进行白细胞分类计数。取 100 μL 细胞悬液进行离心甩片，晾干后进行 Diff-Quik染色，光学显微镜下进行细胞分类计数，数200个细胞，求出各类白细胞百分比，进而计算出各类白细胞的细胞数目。
1.3.2 肺组织中炎症性细胞变化分析
颈椎脱臼处死小鼠，酒精消毒，剪开胸部肋骨取肺脏，放入2 ml含10% FBS的RPMI1640培养基中，培养基再洗1次。弃去RPMI1640培养基，将肺脏剪碎，用IV型胶原酶（1mg/ml）2.5 ml浸泡肺脏，37°C温箱孵育1 h。加MACS液5 ml左右终止消化，反复吹打，在70 μm细胞滤网上研磨肺脏，并反复冲洗滤网，将细胞全部过滤到50 ml离心管中；定容至40 ml，2500 rpm， 4°C离心5 min。去上清，加入3 ml 40%Percoll液并与细胞混匀，转移到15 ml离心管中；1400 ×g， 23 °C离心20 min。 弃上清，加2 ml红细胞裂解液（ACK），混匀，室温裂解2 min后，加MACS液至15 ml终止反应；2500 rpm，4 °C离心5 min。弃上清，加2 ml MACS液，吹打混匀，将单细胞70 μm筛网过滤至15 ml离心管中，过滤完再用MACS冲一下滤网；2500 rpm，4 °C离心5 min。弃上清，细胞沉淀用 0. 4 mL PBS 重悬，并用血细胞计数板进行细胞分类计数。取 100 μL 细胞悬液进行离心甩片，室温晾干后进行 Diff - Quik染色，光学显微镜下进行细胞分类计数 ，求数200个细胞，求出各类白细胞百分比，进而计算出各类白细胞的细胞数目。
1.3.3 统计分析
每组 3 只或 3 只以上小鼠，实验独立重复 3 次以上。使用GraphPad Prism6.0 软件。使用独立样本t检验分析数据， *表示 P<0.05，**表示 P<0.01，***表示 P<0.005，****表示 P<0.0001。
2.结果
2.1 阿司匹林对BALF中炎症性细胞的影响。
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图2. 各组小鼠肺组织中炎症性细胞分类计数的比较
对肺组织中炎症性细胞进一步观察，发现与BALF中相类似的结果，阿司匹林干预组（papain +aspirin组）小鼠肺组织中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞细胞数目与阳性对照哮喘组（papain组）相比也都显著性下降，差异均有统计学意义 （均Ｐ＜0.05），但与正常对照组（pbs组）相比，统计无明显差异，见图 2。
3.讨论：
阿司匹林是医药史上三大经典药物之一，是应用最广、最早和最 普遍的解热镇痛药与抗风湿药。它具有抗血小板聚集、解热、抗炎、阵痛多方面的药理作用。有相当一部分研究认为，当摄入阿司匹林和其他非甾体类抗炎药后会出现急性上、下呼吸道反应，即阿司匹林加重性呼吸系统疾病(aspirin-exacerbated respiratory disease,AERD)[2] [3] 。但流行病学调查显示 AERD 在一般人群的患病 率只有约 0.3%~2.5%[4] 。不可忽视的是，阿司匹林在过敏性哮喘的防治中发挥了不可替代的作用。早在 1973 年就有过关于阿司匹林能使部分哮喘病人缓解的报道，1983年 Szezeklik 等人又报道 6 例哮喘病人服用阿司匹林 0.3g~1.2g 后，起到明显的支气管舒张作用， 临床症状和高峰呼气气流速均有改善[5] [6]。张波[7]研究证明阿司匹林对支气管哮喘患儿外周血单核细胞分泌 IL-2 有上调作用，对 IL-4 的分泌有下调作用; 吴树君[8] 研究得出适量的阿司匹林对气管平滑肌的扩张具有较好的作用功效，上述两个研究[7] [8] 皆是进一步说明阿司匹林可用于治疗慢性支气管哮喘。但是，阿司匹林能否影响急性过敏性哮喘的症状，尚未报道。我们的研究表明阿司匹林能通过减少BALF和肺组织中炎症性细胞，即嗜酸性粒细胞和中性粒细胞细胞数量，减轻过敏性哮喘炎症症状。哮喘的一线用药糖皮质激素并不能抑制哮喘中所有炎症反应，且其副作用与依赖性不容小觑。寻找安全、有效的替代药物已是必然趋势。因此，本研究可能减少了哮喘病人对皮质类固醇的依赖，为研制新的哮喘防治手段提供新思路。
参考文献
[1]Boonpiyathad T,S zener ZC,Satitsuksanoa P,Akdis CA: Immunologic mechanisms in asthma. Semin Immunol, 2019, 46:101333.
[2]José Carlos RodríguezJiménez, Morenopaz FJ , Luis Manuel Terán, et al. Aspirin exacerbated respiratory disease: Current topics and trends[J]. Respir Med,2018,135:62-75.
[3]张财云,陈蔚. 对阿司匹林加重性呼吸系统疾病的研究进展[J].当代医药论丛,2018,16(22):19-21.
[4]J.-H. Choi, J.-H. Kim, H.-S. ParkUpper. Airways in aspirin-exacerbated respiratory diseaseCurr. Opin. Allergy Clin. Immunol,2015,15:21-26.
[5]Szezeklik A. Asthma improved by aspirin-likr drugs. Br J Dis Chest,1983,77:153.
[6]纪树国,王志. 一个矛盾的临床现象——阿司匹林类药既能诱发哮喘又能缓解哮喘[J]. 实用内科杂志,1987, 05:258-259.
[7]张波. 阿司匹林对哮喘患儿IL-2和IL-4的调节作用[J]. 江苏医药,2010,36(17):2019-2020.
[8]吴树君. 阿司匹林对在体及离体气管平滑肌的影响[J]. 海峡药学,2017,29(09):115-116.
基金项目:国家级大学生创新创业训练计划(201910439007)。
作者简介: 王爱帝，2016级临床医学本科。
#并列第一作者。
*通讯作者:景秀丽，女，副教授，主要从事呼吸道黏膜免疫相关研究。