黄娟*，刘桂香
（重庆科瑞制药（集团）有限公司 重庆南岸区 400060）
摘要：目的：建立醋酸曲安奈德乳膏中控制菌（金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）质量控制方法。方法：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液10ml，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时，同时做阳性对照试验和阴性对照试验。结果：控制菌（铜绿假单胞菌和铜绿假单胞菌）检查用培养基及检测方法的适用性符合要求，试验组和阳性对照组均能有效检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，阴性对照均未检出。结论：该检测方法可行，能有效控制产品的控制菌。
关键词：醋酸曲安奈德乳膏；金黄色葡萄球菌；铜绿假单胞菌。
醋酸曲安奈德是一种中效的糖皮质激素，具有抗炎、抗瘙痒、收缩血管的作用，同时还有抗水钠潴留的作用。在这些作用中最强的是抗炎作用，作用机制是一种中强效的糖皮质激素，可以较长、较持久的对皮肤病起到抗炎作用。外用可以做成软膏、乳膏以及滴眼液涂抹于患处。笔者根据《中国药典》2015年版四部对外用乳膏剂的微生物控制要求，乳膏剂中应不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，通过控制菌试验方法学验证，对企业生产的醋酸曲安奈德乳膏的控制菌进行检测评价，现报道如下：
1 仪器与试药
CSH-222J-生化培养箱（重庆创测科技有限公司），LDZX-75KBS-立式压力蒸汽灭菌器（上海申安科学仪器有限公司）；枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63 501、金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26 003、铜绿假单胞菌CMCC（B）10 104、白色念珠菌CMCC (F) 98 001、 黑曲霉CMCC(F)98 003均来自中国药品生物制品检定研究院；沙氏葡萄糖液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液均来自北京路桥技术有限公司；醋酸曲安奈德乳膏（国药准字H50020632，规格：10g：10mg，批号：191001、191101、191102，重庆科瑞制药（集团）有限公司）。
2 方法与结果
2.1菌液制备
（1）取新鲜的金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35℃培养18～24小时，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液，做活菌计数用。
（2）取新鲜的白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基，经20～25℃培养2～3天，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液，做活菌计数用。
（3）取新鲜的黑曲霉菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，经20～25℃培养5～7天，获得丰富的孢子，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将霉菌孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液，做活菌计数备用。
（4）控制菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌）的检查菌液的制备
取新鲜的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的培养物接种于胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35℃培养18～24h，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml不大于100cfu的菌悬液。
2.2 计数培养基适用性检查
（1）培养基接种及观察：分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各1ml注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30~35℃培养3天，计数；分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌各1ml注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置20~25℃培养5天，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
（2）结果：被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌生长良好，判该培养基的适用性检查符合规定。
2.3控制菌的检查方法适用性试验
（1）铜绿假单胞菌促生长能力检查：分别接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基和对照培养基中，在30～35℃培养18～24小时，结果：与对照培养基管比较，被检培养基试验菌应生长良好。
（2）铜绿假单胞菌抑制能力检查：接种不少于100cfu的大肠埃希菌于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基和对照培养基中，在30～35℃培养18～24小时，与对照培养基管比较，试验菌应不得生长。
（3）金黄色葡萄球菌促生长能力检查：分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌于甘露醇氯化钠琼脂培养基和对照培养基中，在30～35℃培养18～24小时，结果：与对照培养基管比较，被检培养基试验菌应生长良好。
（4）金黄色葡萄球菌抑制能力检查：接种不少于100cfu的大肠埃希菌于甘露醇氯化钠琼脂培养基和对照培养基中，在30～35℃培养18～24小时，结果：与对照培养基管比较，试验菌应不得生长。
（5）指示特性检查：用涂布法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于甘露醇氯化钠琼脂培养基和对照培养基平板上，在30～35℃培养18～24小时，结果：被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等与对照培养基一致。
2.4控制菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌）检查方法适用性试验
2.4.1试验组：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液10ml，分别接入不大于100cfu的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的菌悬液1ml，加入100ml胰酪大豆液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。
2.4.2阳性对照试验： 取不大于100cfu金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的菌悬液1ml，加入100ml胰酪大豆液体培养基中，混匀，于30～35℃培养18～24小时。
2.4.3供试品对照组：取1：10供试液10ml，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。
2.4.4阴性对照试验：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，加入100ml胰酪大豆液体培养基中，混匀，于30～35℃培养18～24小时。
2.4.5选择和分离培养
（1）铜绿假单胞菌的选择和分离培养：取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验，或采用其他适宜方法进一步检定。
（2）氧化酶试验：将洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸N,N-二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。
（3）金黄色葡萄球菌的选择和分离培养：取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。
结果判断：若上述试验组检出试验菌，按此供液试液制备方法和控制菌检查方法进行供试品的控制菌检查，阳性对照试验组应有菌生长，阴性对照试验组应无菌生长，若未检出试验菌，应采用其它方法消除供试品的抑菌性，并重新进行方法适用性试验。分别进行3次独立的平行试验。结果：金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查方法的验证结果显示实验组和阳性对照组控制菌均生长良好，阴性对照组均未检出。
2.5醋酸曲安奈德乳膏样品控制菌检测
（1）供试液制备和增菌培养：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液10ml，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。
（2）阳性对照试验：按供试液制备同法操作，分别在其中接入不大于100cfu的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的菌悬液1ml，作为阳性对照。
（3）阴性对照试验：取稀释液10ml，不加供试液同法操作，作为阴性对照。
（4）选择和分离培养：分别取上述培养物，分别接种于对应的培养基中，30～35℃培养18～24小时。
结果判断：若十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行氧化酶试验（将洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸N,N-二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性），或采用其他适宜的方法进一步检定；若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的检定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但检定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。详细检测结果参见表1
表1 三批上市产品控制菌检查结果
讨论
在检测过程中，均按照《中国药典》2015年版四部控制菌检测方法进行试验，其方法的判断结果准确，我公司连续3批生产样品均未检出铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，说明车间质控严格，未带入致病菌，产品质量可靠。