邢争[]，王冰*，孟繁朔，赵元静，李运芝
（辽宁中医药大学，辽宁大连，116600）
摘要：目的：探讨牛膝治疗骨质疏松的有效成分及作用机制。方法：筛选牛膝的有效成分，并收集其对应的作用靶点；检索与OP相关的靶点；有效成分与疾病的交集靶点；进行“成分-靶点”网络和蛋白质相互作用网络的构建与分析，通过DAVID生物信息学资源数据库进行KEGG通路富集分析。结果：筛选有效成分10个，交集靶点有18 个。“成分-靶点”网络节点28 个。PPI 网络节点15个。KEGG富集通路7 条。结论：牛膝治疗OP作用机制可能与参与细胞分化和凋亡、代谢、炎症反应等途径有关。
关键词:牛膝；骨质疏松；网络药理学；有效成分；作用机制.
怀牛膝也叫牛膝（Achyranthes bidentata Blume），为苋科多年生草本植物牛膝的干燥根。具有：活血祛瘀，补肝肾，强筋骨，饮血下行，利尿通淋的作用。现代药理学研究显示，牛膝具有良好的抗骨质疏松作用[1-2]。网络药理学具有生物信息学、多向药理学、计算机科学等多学科的技术和知识，可多方位地阐释药物治疗疾病的潜在作用机制，能体现药物多用的整体性和系统性特点。当前，网络药理学已经被应用于中药复方的配规律、复方优化、新药开发、中药活性成分筛选和药物-症候研究等方面。为复杂中药研究提供了中药的方法。本实验应用网络药理学研究怀牛膝对抗骨质疏松活性成分及其作用机制，为怀牛膝对抗骨质疏松研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 怀牛膝药效成分的筛选和靶点的预测
采用计算系统生物学实验室数据库（TCMSP）和国家人口与健康科学数据共享平台（NSTI）共同确定怀牛膝成分，筛选牛膝药效成分。采用CHEMBL数据库预测药物靶点收集人缘蛋白。并采用UniProt数据库确定蛋白基因名称[3]。
1.2 疾病靶点的预测
以“osteoporosis”为关键词，分别在CTD, GeneCards和TTD数据库进行基因筛选，取三个数据库共有基因作为疾病基因。
1.3 牛膝成分-疾病-靶点网络的构建与分析
将药材成分靶点与骨质疏松疾病靶点取交集，将数据输入Cytoscape 软件中，构建“成分-靶点”网络。其节点表示牛膝成分与疾病靶点，边表示成分与疾病的关系。
1.4 对确定基因的GO富集分析与PPI网络构建
从细胞组成，生物过程和分子功能三个方面分析。
应用David在线功能注释工具进行GO富集分析，以误差率P<0.05为标准进行筛选，获得目标基因所涉及到疾病。应用String数据库研究靶标蛋白之间的关系，得到PPI图，分析各靶标蛋白之间的关系。
2 实验结果
2.1 怀牛膝化学成分和作用靶点网络的构建
通过数据库共认证10个化学成分。整个网络中共10个成分，18个靶蛋白，共28个靶点，节点共形成178条边。各靶点与成分对应关系紧密。体现出多成分-多靶点-多做用，且相互联系紧密的关系。
2.2 靶点间相互作用关系
通过String平台进行靶点（蛋白）相互作用关系分析（PPI），分析牛膝主要成分的作用机制，节点间相关连接线条越多，关系越密切。MTOR,FGFR1, CASP3，EGFR，ESR2，ESR1，PPARG，CYP3A4，NR3C1等蛋白相互作用较强，可能为牛膝抗骨质疏松作用重要靶点。
2.3 牛膝抗骨质疏松作用KEGG PATHWAY通路分析
应用David在线平台，分析P<0.05的牛膝抗骨质疏松作用信号通路。共分析3条信号通路，其中hsa05205信号通路P值最小，且包含5个相关基因，建议其为牛膝抗骨质疏松作用主要信号通路。
2.4 GO富集分析
应用David数据平台，对上述基因进行GO富集分析分析对BP,CC和MF三个方面进行分析。分析结果可见生物过程多与RNA聚合酶II启动子的转录，类固醇激素介导的信号通路，信号转导，RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控，RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的负调控有关；细胞组分多为V受体复合物,核质,核,胞外区,溶酶体等有关；分子功能多为类固醇激素受体，类固醇结合，酶结合，维甲酸X受体结合，序列特异性DNA结合等方面。
3 小结与讨论
牛膝治疗OP 的PPI 网络分析结果显示，18 个靶点蛋白中，MTOR,FGFR1, CASP3，EGFR，ESR2，ESR1，PPARG，CYP3A4，NR3C1等蛋白，可能为牛膝发挥治疗作用的关键靶点。KEGG PATHWAY通路富集结果显示，牛膝治疗OP 的潜在作用靶点编码基因主要富集在癌症中蛋白多糖、癌症中心碳代谢、癌症通路、前列腺癌症、雌激素信号通路等通路上。基于网络药理学分析可获得牛膝治疗OP 的可能有效成分及潜在作用靶点。
参考文献：
[1]高昌琨.怀牛膝对维甲酸所致大鼠骨质疏松防治作用的实验研究[J].基层中医药，2001,15（2）：9-11.
[2]牛膝提取物对去卵巢大鼠骨密度、骨转换及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响[J].中国骨质疏松杂志，2011,17（2）：109-112.
[3]KE H，LIU Y，ZHOU X，et al. Anterior fissureless uniportvs. posterior intra-fissure triple-port thoracoscopic rightupper lobectomy：a propensity-matched study[J]. J Thorac Dis，2017，9（10）：3866-3874.