饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测方法的改良杨德富--中国期刊网

字体：大中小

首页> 原创作品> 正文

饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测方法的改良杨德富

发表时间：2020/8/19 来源：《基层建设》2020年第12期作者：杨德富

[导读] 摘要：产气英膜梭菌是一种革兰氏阳性杆菌，产芽孢，本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要求并不太严，广泛地存在于自然界的土壤、污水、粪便及人畜肠道中，是正常肠道菌群的成员之一，也是一种条件致病菌，通常被用作粪便污染的指标，可引起人创伤性气性坏疽和食物中毒、痢疾等各种疾病。产气荚膜梭菌产芽孢，对污水净化处理的各种措施具有较强抵抗力，其数量与水污染程度有关，因此也被认为是水质的指标。

        新疆坎儿井水务科技有限公司新疆吐鲁番 838000
        摘要：产气英膜梭菌是一种革兰氏阳性杆菌，产芽孢，本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要求并不太严，广泛地存在于自然界的土壤、污水、粪便及人畜肠道中，是正常肠道菌群的成员之一，也是一种条件致病菌，通常被用作粪便污染的指标，可引起人创伤性气性坏疽和食物中毒、痢疾等各种疾病。产气荚膜梭菌产芽孢，对污水净化处理的各种措施具有较强抵抗力，其数量与水污染程度有关，因此也被认为是水质的指标。《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》规定，饮用天然矿泉水需检测产气荚膜梭菌。
        关键词：饮用水；天然矿泉水；产气荚膜梭菌检测；改良方法
        引言：将饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测国标方法GB8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》作一些改良，以使检测结果更加准确可靠。用产气荚膜梭菌CICC22949人工污染的水样通过孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，改良后的方法在滤膜上有黑色可疑菌落，而国标方法滤膜上的菌落无黑色。TSC培养基上目标菌计数值显著高于SPS培养基计数值（P<0.05）。用新鲜配制的TSC培养基经双层培养基覆盖改良后的方法检测产气荚膜梭菌，现象更明显，结果更可靠，更适合饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验。产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）因能分解肌肉和结缔组织中的糖类产生大量气体并在体内形成荚膜而得名，该菌是后壁菌门梭状芽胞杆菌属的一种，呈粗短的大杆状，无鞭毛，专性厌氧的革兰氏阳性菌。多以芽胞形式分布于土壤等自然界中，也存在于人、动物及其肠道中，是肠道的正常菌群之一，同时也是一种条件致病菌。
        1.材料与方法
        1.1菌株
        产气荚膜梭菌（ＡＴＣＣ１３１２４），购自中国食品药品检定研究院
        1.2主要培养基和试剂
        亚硫酸盐-多黏菌素-磺胺嘧啶琼脂、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（tryptose-sulfite-cycloserineagar，TSC）、液体硫乙醇酸盐培养基（thioglycollatemedium，FTG）、动力-硝酸盐培养基、缓冲动力-硝酸盐培养基、含铁牛奶培养基、卵黄琼脂培养基、血平板、革兰氏染色液：北京陆桥技术股份有限责任公司；孔径为0.22μm的无菌滤膜：广东环凯微生物科技有限公司；饮用矿泉水：坎儿井天然矿泉水。
        1.3检测样品
        制备测量审核样品的处理方法：根据中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供的《测量审核作业指导书》，总计需要用520ｍＬ灭菌稀释液再水化，稀释液为灭菌0.1％（质量分数，全文同）蛋白胨水。无菌开启西林瓶后立即加人10ｍＬ灭菌0.1％蛋白胨水进行再水化，待溶解后，吸出放人无菌瓶中，再反复用余下的灭菌0.1％蛋白胨水清洗西林瓶内壁，回收清洗液放人上述无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液（本次冻干的能力验证样品等同于520ｍＬ的待测矿泉水样品）。
        1.4菌悬液的制备
        将保藏于磁珠中的标准储备菌株接种于血平板上并置于36℃培养箱中厌氧培养，待血平板上长出明显菌落，再挑取上述血平板上的单菌落接种于FTG培养基并于36℃厌氧培养24h，用0.85%的无菌生理盐水连续梯度稀释培养后的FTG培养基，控制菌浓度在10CFU/mL~102CFU/mL，无菌吸取1mL稀释后的菌液加入到50mL无菌矿泉水中作为人工污染样品。
        1.2检测方法
        按照国标方法GB8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》，取50mL用产气荚膜梭菌CICC22949人工污染的水样经孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，将滤膜移至SPS培养基上，于36℃厌氧培养24h，观察结果。

期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆

        1.3改良
        改良方法1：双层培养基覆盖法水样过滤同1.4.2方法，将滤膜紧贴于SPS培养基上后，先覆盖一层（约10mL）SPS培养基，待其凝固后再加盖一层（约5mL）SPS培养基，待培养基凝固后于36℃厌氧培养24h，观察结果。
        改良方法2：培养基优选采用双层培养基改良法，分别选择低浓度、中浓度、高浓度标准菌株菌悬液，应用SPS培养基和TSC培养基对人工污染水样进行检测，各自计数黑色菌落，对定量检测结果进行分析比对。同时取无菌矿泉水，采用双层培养基覆盖改良法检测作为空白对照。
        确证试验：将可疑菌落接种于FTG36℃培养基厌氧培养24h，参照国标法分别做革兰氏染色镜检、硝酸盐还原试验、牛奶发酵试验、卵磷脂分解试验。
        3.结果与分析
        3.1国标法和改良法的试验结果对比
        国标法滤膜上的菌落无黑色，采用双层培养基覆盖改良方法1滤膜上有典型的黑色菌落，效果明显。产气荚膜梭菌在厌氧条件下能把TSC和SPS培养基中的亚硫酸盐还原为硫化物，再与柠檬酸铁铵反应产生硫化铁而使菌落呈黑色。除产气荚膜梭菌外，其它的梭状芽孢杆菌则被添加的抗生素所抑制，因此滤膜上的黑色菌落具有一定的特征性。产气荚膜梭菌在培养基上生长过程中，硫化物的产生和铁离子的直接接触是菌落呈现黑色的关键因素。由此推测，国标法因为滤膜的阻隔使细菌不能直接接触到培养基中的铁离子，从而不能产生黑色的硫化铁，故菌落不呈黑色。在滤膜上加盖一层培养基后，目标菌能和培养基充分接触，因此能有效的避免上述情况，使平板上出现明显的黑色菌落。当滤膜上的目标菌较多的时候，覆盖第一层培养基的过程中可能会把部分滤膜上的产气荚膜梭菌带到培养基表面，使菌落不显黑色或者黑色不明显而影响计数结果。当其凝固后滤膜上的产气荚膜梭菌已固定在培养基里面或者表面，最后再加盖一层培养基，这样可以让所有的产气荚膜梭菌都完全在培养基里面，经36℃厌氧培养后都能显示明显的黑色。
        3.2结果
        镜检可见该菌为革兰氏阳性粗大杆菌，偶见芽孢，硝酸盐还原试验、卵磷脂分解试验和牛奶发酵试验均为阳性。产气荚膜梭菌能产卵磷脂酶分解卵黄平板中的卵磷脂，因此点种点周围会出现乳白色的浑浊带；且此菌无动力，穿刺线不呈扩散生长，能还原硝酸盐，培养基变红色；产气荚膜梭菌会发酵乳糖，凝固酪蛋白，呈“爆裂发酵”现象，培养基不变黑。此外，试验结果发现，与动力硝酸盐培养基相比，采用缓冲动力硝酸盐培养基进行硝酸盐还原试验，显色反应更快速，色差显示更明显
        结束语
        综上所述，从检测方法完善和培养基优选两方面对矿泉水中产气荚膜梭菌滤膜检测国标法进行改良，用新鲜配制的TSC培养基经双层培养基覆盖改良后的方法检测产气荚膜梭菌，现象更明显，结果更可靠，更适合饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验。提高了饮用矿泉水中产气荚膜梭菌检测的准确性。
        参考文献
        [1]姚积源,居建华,顾伟忠,等.产气荚膜梭菌检验培养基—改良SPS的研究[J].中国卫生检验杂志,2002,12(3):339
        [2]潘宝怡,吴清平,彭飞艇,等.饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测国标方法的改进[J].现代食品科技,2012,28(9):1236-123
        [3]唐玲玲,石玉玲.产气荚膜梭菌实验室诊断方法综述[J].热带医学杂志,2012,12(3):355-358
        [4]国家卫生健康委员会. 食品安全国家标准饮用天然矿泉水:GB8537-2018[S]. 北京: 中国标准出版社, 2018
        [5]吴清平,魏磊,张菊梅.产气荚膜梭菌特异性显色培养基研究进展[J].中国卫生检验杂志,2017,27(15):2277-2280
        [6]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 食品安全国家标准食品微生物学检验饮用天然矿泉水检验方法:GB 8538-2016[S]. 北京: 中国标准出版社, 2016