【摘要】目的 评价严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SAS-CoV-2）特异性免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）检测在2019年新型冠状病毒疾病（COVID-19）诊断中的应用价值。方法 本试验采用回顾性研究方法，收集了2020年1月20日～4月16日确诊为COVID-19患者的94例血清标本为研究对象，对照组为161例确诊为非COVID-19的其他疾病患者的血清标本。通过胶体金免疫层析法检测血清中的SARS-CoV-2特异性IgG和IgM抗体，分析抗体检测对COVID-19的诊断价值。结果 SAS-CoV-2特异性IgG/IgM抗体诊断COVID-19的敏感性96.81%，特异性98.14%，准确度97.65%，显示出良好的诊断效果；发病时间在0-7d的COVID-19患者的IgG抗体阳性和IgM抗体阳性结果间的差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 SAS-CoV-2特异性IgG或IgM抗体检测在COVID-19的临床诊断中有重要应用价值，是COVID-19的重要诊断和筛查指标。
【关键词】IgG检测；IgM检测；SARS-CoV-2；COVID-19
2019新型冠状病毒病（Corona virus disease 2019, COVID-19）是由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（Severe acute syndrome coronavirus2, SARS-CoV-2）引发的传染性疾病，其传染性极强，在全球范围内广泛传播，引起的全球性公共卫生危机已经导致全球性的社会和经济问题[1]。临床以实时荧光定量RT-PCR检测为主要病原学确诊标准，由于采样部位和方法、样本保存、检测方法和试剂盒质量等因素，存在假阴性和时效性等问题[2-3]。使检测结果与临床表现不一致，这是疫情当下急需解决的问题。目前除中国大陆外，大部分国家和地区的疫情仍然未有效控制，尽管多国已在研发疫苗并取得一定进展，但做好早发现和早诊断对疫情的控制和生产生活的恢复有重要意义[4]。国家卫生健康委办公室和国家中医药管理局办公室于2020年3月4日发布《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》中增加血清学检测结果为COVID-19患者确诊的依据之一[5]。本研究通过检测血清、血浆或全血中的SAS-CoV-2特异性免疫球蛋白IgG或IgM抗体，分析其与病程的关系，评价IgG和IgM抗体检测在COVID-19诊断中的应用价值。
1 研究对象与方法
1.1研究对象
收集2020年1月20日～4月16日确诊的94例COVID-19患者和161例经核酸检测排除SARS-CoV-2感染的为非COVID-19的其他疾病患者，所有研究对象均抽取一份血标本。纳入标准为确诊组：COVID-19患者符合《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第三版)》中确诊或疑似病例诊断标准[6]；对照组：其他疾病患者，经病原学检测排除SARS-CoV-2感染。
1.2检测试剂和方法
SARS-CoV-2特异性IgG和IgM抗体检测试剂盒由深圳迈科龙生物技术有限公司提供，取血清20μl加入至样品添加孔，随后加入40μ样本稀释液，室温(20～25℃)孵育10min，观察检测结果，操作过程严格按照试剂盒说明书要求并在生物安全柜内进行。检测结果判定：（1）阳性(+):在检测区(IgM) (IgG)和质控区(C)均出现紫红色条带，表明标本中存在SARS-COV-2 lgG和IgM抗体；如果只出现两个紫红色条带，一个在检测区(IgG) 或(IgM)，另一个在质控区(C)，结果表明，样品中仅存在lgM或lgG抗体。（2）阴性(-): 仅在质控区(C) 出现紫红色条带，在检测区(IgG/IgM)没有出现紫红色条带。（3）无效:质控区域(C)不显示紫红色条带。表示操作不当或者试剂盒已经失效，需用新的试剂盒重新测试。
1.3统计学分析
使用Graphpad prism 6.0软件进行数据的分析比较。计数资料以（n, %）表示，进行χ２检验；计量资料以(x±s）表示，进行t检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。
2结果
2.1 SARS-CoV-2特异性的IgG和IgM抗体检测结果
COVID患者中IgG阳性89例（94.68%），IgM阳性78例（82.98%），IgG/IgM（IgG和IgM抗体任一阳性即确定为阳性）阳性91例（96.81%）；对照组标本中IgG和IgM均阳性的1例（0.62%），单IgG阳性1例（1.24%），单IgM阳性1例（1.24%）。
2.2 SARS-CoV-2特异性IgG和IgM抗体检测对COVID-19的诊断敏感度和特异性
以核酸检测阳性或为金标准，IgG/IgM诊断COVID-19的敏感性96.81%，特异性98.14%，准确度97.65%，阳性似然比51.95，阴性似然比0.03，约登指数0.95。IgG阳性、IgM阳性、IgG/IgM阳性诊断敏感性间的差异有统计学意义（P＜0.01），IgG/IgM的诊断敏感性最高。见表1。
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2.3 SARS-CoV-2特异性IgG和IgM抗体检测与患者病程
COVID患者中有4例为主动筛查发现的无症状感染者，即患者检出IgG/IgM阳性的时间早于核酸确诊时间（发病天数＜0），对不同病程患者的IgG和IgM检测情况进行分析，结果显示发病时间在0~7d时，IgG阳性和IgM阳性结果间的差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。
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3讨论
COVID-19是由SARS-CoV2感染下呼吸道引发炎症和呼吸功能障碍性疾病，临床症状大多较严重急性呼吸综合征(SARS)或中东呼吸综合征(MERS)轻，但是传染性强且有致死风险，严重威胁人民群众的身体健康和生命安全[7]。据世界卫生组织报道：截至2020年6月4日，全球累计确诊人数已超过650万例，累计死亡人数超过38万例，是1918年大流感疫情以来最严重的一次流行病疫情。COVID-19的临床表现大致可分为三个阶段：初期为病毒携带的无症状感染，轻症患者表现为上呼吸道感染，严重者出现缺氧、肺部“磨玻璃样”病变及高病毒载量的急性呼吸道窘迫综合征[8]。目前仍没有专门批准用于治疗COVID-19的药物或疫苗，开发新的有效的药物或疫苗干预措施仍需数月至数年的时间。国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎防控方案（第六版）》中指出各地应做好“早发现、早报告、早隔离、早治疗”的防控工作，并增加了血清学检测作为病例确诊的方法之一，强化了血清学检测对COVID-19确诊的必要性[9]。
机体感染SARS-CoV-2后会产生特异性IgG和IgM抗体，本研究结果显示通过SARS-CoV-2特异性IgG/IgM诊断COVID-19的准确度97.70%，敏感性97.00%，特异性98.14%，SARS-CoV-2特异性IgG/IgM阳性显示出良好的临床诊断效果。IgG阳性率高于IgM抗体阳性率，和徐万洲等[10]的报道一致。Liu等[11]研究发现随着发病天数的增加COVID19患者IgG和IgM的阳性率增加，35d后IgM水平下降；和基于核衣壳蛋白的ELISA抗体相比，基于SARS-CoV2刺突蛋白的ELISA抗体对IgM的检测敏感性更高。本研究中患者采样至确诊的时间在0~85d之间，中位数为14d，发病时间＜0d的COVID-19患者中，IgG阳性率达100%，IgM阳性率达75%，说明在无症状感染者或疾病早期患者机体即出现特异性体液免疫应答；0~7d时IgG阳性率显著高于IgM阳性率，IgG阳性率（92.86%）处于较高水平，可能和IgG抗体参与SARS-CoV2在体内存在的病毒感染增强效应（Antibody-dependent enhancement, ADE）有关，有研究显示，疾病早期产生的活性较差的抗体反而会导致促进炎症反应和病毒持续复制，加重细胞损伤[12]，IgM抗体阳性多在发病3-5d开始出现，阳性率为57.14%；随着发病天数的增加IgM阳性率逐渐升高，病程在8-14d和15-18d IgM抗体阳性率分别为81.82%和93.75%，28d后IgM阳性率（90.91%）有所降低，IgG抗体阳性率在8-14d、15-28d和28d以后均大于90%，处于较高水平，说明多数患者体内均存在特异性的的体液免疫应答，28d后患者的IgM阳性率和IgG阳性率稍有降低，提示随着病情的好转和恢复，患者体内特异性抗体的水平或者效价可能降低。
胶体金法在SARS-CoV-2特异性IgG和IgM抗体检测中显示良好的应用效果[13]，本研究通过胶体金免疫层析法对血清中的IgG和IgM抗体进行检测，操作方便快捷，采样方便，室温环境即可进行，10min即可判定检测结果，方便对疑似COVID-19患者进行主动筛查。由于免疫应答存在个体间差异，抗体检测受窗口期影响等原因，仅通过SARS-CoV-2特异性的IgG或IgM抗体诊断早期COVID-19仍可能存在假阴性，存在漏诊风险，Guo等[14]研究显示联合应用RT-PCR和SARS-CoV-2特异性的IgM抗体检测显示出更好的诊断效果。
SARS-CoV-2特异性的IgG或IgM抗体检测对COVID-19的临床确诊有重要的意义，提升不同疾病阶段时血清学免疫抗体的认识，有助于COVID-19的筛查和诊断。
致谢：感谢深圳市沙井人民医院等单位提供的COVID-19确诊患者的血液标本。感谢深圳市迈科龙生物技术有限公司提供的新型冠状病毒COVID-19 IgG/IgM检测试剂盒。
声明：本论文发表与深圳市迈科龙生物技术有限公司不存在利益关系。
参考文献
[1] Infantino M, Grossi V, Lari B, et al. Diagnostic accuracy of an automated chemiluminescent immunoassay for anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG antibodies: an Italian experience. [published online ahead of print, 2020 Apr 24]. J Med Virol. 2020;1-5. doi:10.1002/jmv.25932.
[2] 邱峰, 王慧君, 张子康, 等. 新型冠状病毒SARS-CoV-2的实验室检测技术[J]. 南方医科大学学报, 2020, 40(02):164-167.
[3] 常颜信, 徐明霖, 傅晓辉, 等. 新型冠状病毒咽拭子核酸检测法假阴性调查分析[J/OL].第二军医大学学报:1-4[2020-05-27]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/31.1001.R.20200522.1159.002.html.
[4] Zhu FC, Li YH, Guan XH, et al. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial [published online ahead of print, 2020 May 22]. Lancet. 2020;S0140-6736(20)31208-3. doi:10.1016/S0140-6736(20)31208-3.
[5] 国家卫生健康委员会．新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）[EB/OL]. (2020-3-4)http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s7653p/202002/8334a8326dd94d329df351d7da8aefc2/files/b218cfeb1bc54639af227f922bf6b817.pdf.
[6] 国家卫生健康委员会．新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第三版）[EB/OL]. (2020-1-22)http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s7653p/202001/f492c9153ea9437bb587ce2ffcbee1fa/files/39e7578d85964dbe81117736dd789d8f.pdf
[7] Chen Y, Liu Q, Guo D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. J Med Virol. 2020;92(4):418‐423. doi:10.1002/jmv.25681.
[8] Nile SH, Nile A, Qiu J, et al. COVID-19: Pathogenesis, cytokine storm and therapeutic potential of interferons [published online ahead of print, 2020 May 7]. Cytokine Growth Factor Rev. 2020;S1359-6101(20)30070-8. doi:10.1016/j.cytogfr.2020.05.002.
[9] 中华人民共和国国家卫生健康委员会 . 关于印发新型冠状病毒肺炎防控方案（第六版）的通知 (国卫疾控函〔2020〕204 号)[EB/OL]. (2020-03-07). http://www.nhc.gov.cn/jkj/s3577/202003/4856d5b0458141fa9f376853224d41d7.shtml.
[10] 徐万洲, 李娟, 何晓云, 等. 血清2019新型冠状病毒IgM和IgG抗体联合检测在新型冠状病毒感染中的诊断价值[J/OL]. 中华检验医学杂志, 2020(03):230-233.
[11] Liu W, Liu L, Kou G, et al. Evaluation of Nucleocapsid and Spike Protein-based ELISAs for detecting antibodies against SARS-CoV-2 [published online ahead of print, 2020 Mar 30]. J Clin Microbiol. 2020;JCM.00461-20. doi:10.1128/JCM.00461-20.
[12] Yajing Fu, Yuanxiong Cheng, Yuntao Wu. Understanding SARS-CoV-2-Mediated Inflammatory Responses: From Mechanisms to Potential Therapeutic Tools [published online ahead of print, 2020 Mar 3].VIROLOGICA SINICA. Doi:10.1007/s12250-020-00207-4
[13] 张稳健, 吕欣, 黄驰, 等. 胶体金免疫层析法检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的临床评价与应用[J/OL].病毒学报:1-7[2020-05-27].https://doi.org/10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003676.
[14] Guo L, Ren L, Yang S, et al. Profiling Early Humoral Response to Diagnose Novel Coronavirus Disease (COVID-19) [published online ahead of print, 2020 Mar 21]. Clin Infect Dis. 2020;ciaa310. doi:10.1093/cid/ciaa310.