摘要：目的 探讨PDZ连接激酶（PBK）在胶质瘤中的表达其意义。方法 通过癌症基因图谱（TCGA）分析PBK在胶质瘤和正常脑组织中的表达差异及其对预后的影响。RT-PCR检测53例胶质瘤和3例正常脑组织中PBK mRNA的表达，并结合临床参数分析其意义。结果 TCGA数据库分析显示：与正常脑组织相比，PBK高表达于胶质瘤组织（P = 2.763e-04）；PBK高表达的胶质瘤患者总生存期低于低表达患者（P = 0e+00）。RT-PCR发现PBK mRNA在胶质瘤组织中的表达阳性率为75.6％（40/53），而在正常脑组织中不表达。统计分析尚未发现胶质瘤中PBK mRNA的表达与患者的临床病理资料有关。 结论 PBK在胶质瘤中高表达，有望作为胶质瘤靶向治疗的靶点。
关键词：PBK；胶质瘤；靶向治疗；生物信息学
胶质瘤（Glioma）是一类起源于神经胶质细胞的中枢神经系统肿瘤，发病率高，约占成人原发性颅内肿瘤的30-40%。由于其浸润性生长常侵犯邻近脑组织，手术难以根除，术后复发率高，预后较差[1]。尽管目前在术后结合神经成像、放疗和化疗取得一定进展，但仍然无法明显改善患者的预后，因此急需探索新的治疗策略。近年来，靶向治疗是针对致癌位点的治疗方法，因其毒副作用小而备受关注，目前已有贝伐单抗等治疗复发性胶质母细胞瘤的报道[2]，但数量较少，主要是缺乏胶质瘤特异性的靶点。
PDZ连接激酶（PDZ-binding kinase，PBK）是丝裂原活化蛋白激酶激酶 （mitogen activated protein kinase kinanse，MAPKK）分子家族成员[3]。研究发现，PBK高表达于多种恶性肿瘤，在肿瘤发生、增殖、有丝分裂和DNA修复等过程中发挥重要的生物学功能[4]，但在胶质瘤中的相关报道不多。本文通过生物信息学分析结合实验，初步探讨了胶质瘤中PBK的表达及临床意义，旨在寻找靶向治疗的新靶点。
1材料与方法
1.1一般资料
53例胶质瘤组织和3例正常脑组织来自广西医科大学一附院，于2014年1月至2017年12月收集，所有肿瘤组织均经两位病理专业主任医师以盲法检查确诊。胶质瘤患者中男31例，女22例；年龄3～74岁，平均42岁；星型细胞瘤32例，少突胶质细胞瘤6例，胶质母细胞瘤15例；WHO分级I级3例，II级23例，III级12例，IV级15例。本研究经广西医科大学伦理委员会批准。
1.2 TCGA数据库分析PBK的基因表达及绘制生存曲线
癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）是一个在线公共数据集，汇聚了包括胶质瘤在内的大量表达谱数据和临床资料，是生物信息学分析的重要资源。我们通过检索TCGA数据库，获取681例胶质瘤和207例正常脑组织中PBK基因的RNA-Seq数据，分析比较PBK mRNA在其中的表达差异。随后，我们获取数据库中675例胶质瘤组织的生存资料，根据其胶质瘤PBK的表达水平，以表达中位数将其分为高表达和低表达两组，结合患者的预后资料，绘制Kaplan-Meier生存曲线，分析比较两组患者的预后差异。
1.3 总RNA提取与cDNA合成
组织经裂解后进行匀浆，按照试剂盒步骤提取总RNA（细胞/组织总RNA 提取试剂盒，南京诺唯赞生物公司）。紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性，所得RNA逆转录成cDNA（HiScript? III 1st Strand cDNA合成试剂盒，南京诺唯赞生物公司）。GAPDH作为看家基因检测cDNA质量，合成的cDNA于-20℃保存备用。
1.4 目的基因RT-PCR
引物序列及反应条件参照文献[5, 6]（详见表1），采用睾丸cDNA作为阳性对照，不加模板作为阴性对照。反应后产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪观察并拍照。引物由上海生工生物工程公司合成。
表1 PCR引物序列、退火温度及产物长度
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1.5 DNA测序
随机选取PBK阳性的扩增产物，经纯化后送上海生工生物工程公司进行DNA测序，将测序结果输入基因库进行Blast比对。
1.6 统计学方法
采用SPSS 19.0 统计学软件对数据进行分析，卡方检验和Fisher确切概率法比较组间差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。
２结果
2.1TCGA数据库分析PBK mRNA在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达
PBK mRNA在681例胶质瘤组织中的表达（Tumor Mean =6.432）显著高于207例正常脑组织（Normal Mean =0.077），差异有统计学意义（P = 2.763e-04），详见图1。
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图1 TCGA数据库分析PBK在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达
2.2TCGA数据库分析PBK mRNA表达与胶质瘤患者生存期的关系
我们对675例具有预后生存资料的胶质瘤进行分析，结果发现低表达PBK mRNA胶质瘤患者的5年生存率为71%，而高表达患者的5年生存率仅为24%。两者相比，胶质瘤PBK mRNA高表达者的总生存期明显低于低表达者，差异具有统计学意义（P = 0e+00），详见图2。
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图2 TCGA数据库分析胶质瘤患者中不同PBK表达水平的总生存期曲线
2.3RT-PCR检测PBK mRNA在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达
53例胶质瘤组织中，PBK mRNA的表达阳性率为75.6％（40/53），而在3例正常脑组织中均不表达（图3、图4），PBK PCR扩增产物大小约为320bp。随机抽取PCR的阳性产物测序，结果经Blast比对，与基因库检索序列完全一致，证实所扩增产物为PBK的目的片段。
M：Marker；1～7：胶质瘤组织；P：阳性对照；N：阴性对照
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图3 胶质瘤组织中PBK mRNA的表达
M：Marker；1～3：正常脑组织；P：阳性对照；N：阴性对照
图4 正常脑组织中PBK mRNA的表达
2.4PBK mRNA的表达与胶质瘤患者临床病理参数的关系
为探讨胶质瘤中PBK mRNA表达的临床意义，我们结合患者的性别、年龄、肿瘤大小、病理分型、WHO分级、KPS评分、Ki-67和p53等临床资料进行统计分析，结果尚未发现PBK mRNA的表达与患者的临床病理参数相关，详见表2。
表2 PBK mRNA的表达与胶质瘤患者临床病理参数的关系
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３讨论
PBK最初由Gaudet等[3]从Hela细胞cDNA文库中克隆而得，它可与hDlg（the human homologue of the Drosophila Discs-large）的PDZ2结构域结合。该基因定位于染色体8p21.2，含8个外显子，其cDNA全长1811bp，编码蛋白为包含322个氨基酸的丝－苏氨酸激酶，主要通过激活MAPK信号通路中p38、ERK、JNK促进肿瘤细胞生长，从而调控细胞DNA的损伤修复[4]。Hayashi等[7]报道，6种人胶质瘤细胞系中均有PBK mRNA和蛋白的表达；当细胞处于有丝分裂活跃期时，部分PBK会由细胞质向细胞核转移。Joel等[8]敲除PBK基因，可抑制胶质母细胞瘤细胞的生长和瘤球的形成，并伴随大量的细胞凋亡；用PBK抑制剂HITOPK-032抑制其蛋白的功能，会导致小鼠皮下的胶质母细胞瘤生长减缓，提示PBK在胶质瘤的发生和发展中可能发挥重要作用。
本研究中，我们首先通过TCGA数据库分析，发现PBK在胶质瘤组织中的表达显著高于正常脑组织，PBK高表达患者其预后更差，提示PBK可能与胶质瘤的恶性进展有关。随后，我们通过RT-PCR法进行检测，胶质瘤中PBK mRNA的阳性率高达75.6%，而在正常脑组织中不表达，提示它是一个颇有应用前景的肿瘤抗原。统计分析显示PBK mRNA的表达与胶质瘤患者的临床病理参数无关，今后仍需扩大样本例数进行深入研究。为全面客观地评价PBK作为胶质瘤分子靶点的价值，下一步有必要了解其相关蛋白水平及其作用的分子机制，为阐明PBK应用于胶质瘤的靶向治疗提供依据。
参考文献
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[7] HAYASHI T, HAYAKAWA Y, KOH M, et al. Impact of a novel biomarker, T-LAK cell-originating protein kinase (TOPK) expression on outcome in malignant glioma [J]. Neuropathology : official journal of the Japanese Society of Neuropathology, 2018, 38(2): 144-53.
[8] JOEL M, MUGHAL A A, GRIEG Z, et al. Targeting PBK/TOPK decreases growth and survival of glioma initiating cells in vitro and attenuates tumor growth in vivo [J]. Molecular cancer, 2015, 14(121).
作者简介：肖源（1995-），女，汉族，湖南娄底人，硕士研究生。研究方向：肿瘤分子生物学。
通讯作者：罗彬，E-mail: glbinbin2002@yahoo.com。
基金项目：广西高校中青年教师基础能力提升项目（KY2015LX063、2018KY0109）