广西贵港市检验检测中心 广西贵港
摘要：目前食品中霉菌毒素残留量的检测技术无法同时检测多组分的霉菌毒素，对样品基质净化不完全，目标化合物在色谱柱上无法实现基线分离，无法对目标化合物进行准确定量。本文介绍的食品中霉菌检测方法采用改进的QuEChERS方法对食品进行前处理后，利用超高效液相色谱串联质谱法对提取出的26种霉菌毒素同时进行检测，利用高效液相色谱串联质谱的多反应监测模式进行检测，提高了检测效率，节省了检测成本，灵敏度高，重复性好，加标回收率高，同时可以扩展到其他高脂含量样品的检测。
关键词：霉菌；检测方法；食品；探究
1 引言
霉菌毒素是一个全球性问题，据粮农组织估算，全世界每年有大约5%～7%的粮食、饲料等农产品受到霉菌的侵害，25%的谷物被已知霉菌毒素污染，并造成每年数千亿美元的损失。20世纪90年代，加拿大饲料行业由霉菌毒素污染引起损失估计高于10亿美元，而美国则高达25亿美元，同时亚太地区生产的配合饲料受到霉菌毒素污染约为1.6亿吨，每年造成全球高达百亿美元的损失。
霉菌毒素是由一些真菌如曲霉菌、镰刀菌、青霉菌等在生长成熟后所产生的二级代谢产物，这些毒素在谷物的收获、储存、加工、运输等多个环节均可产生。目前已知的霉菌毒素有400余种，主要包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素等。这些毒素耐高温、耐加工过程中的各种处理，毒力强，对人和动物危害极大。如黄曲霉毒素对人畜有强烈的致病性和致癌性，是目前毒性最强危害最严重的真菌毒素。玉米赤霉烯酮(ZEA)是一种生殖系统毒素，可引起雌性激素过多，导致动物雌性化中毒，特别是对猪的作用尤为显著，会导致阴部发生病变，乳腺肿胀，并有卵巢囊肿发生，还可导致小牛性早熟，奶牛阴道炎，发情期延长等。呕吐毒素与奶牛采食量下降和产奶量下降密切相关。呕吐毒素具有免疫抑制作用，在奶牛体内表现更明显。霉菌毒素在谷物、及谷物原料制成的食品中广泛存在。食品中的霉菌毒素超标问题日益严重，尤其是谷物类粮食，易发生霉变的谷物为原料的食品如植物油、面粉、米粉等的霉菌毒素超标严重。此外还有牛奶等畜产品中富集较多的霉菌毒素。对人体健康造成伤害，比如：影响幼儿的发育，增加致癌的概率等。
2 食品中霉菌检测技术分析
目前常用的针对食品中霉菌毒素残留量的检测技术主要有酶联免疫试剂盒 （ELISA）、薄层色谱（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）以及超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）等。酶联免疫法原理是利用抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测；薄层色谱法是根据与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值（Rf）作对比，进行含量测定的方法，这两者均为半定量方法，多用于一种或少数几种毒素的初步筛查；高效液相色谱法是采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析，此法定量准确，但对于同时检测多组分的霉菌毒素，以及对样品基质净化不完全时，目标化合物在色谱柱上无法实现基线分离，无法对目标化合物进行准确定量。
3 食品中霉菌检测方法探究
本文介绍的食品中霉菌检测方法的方法，该方法包括以下步骤：
（1）、对待测食品样品进行提取，先后用含酸的不同浓度的乙腈-水溶液对样品分两次进行振 荡提取、离心，合并两次提取液，得样品提取液；
（2）、对样品提取液进行盐析、除脂，在样 品提取液中加入硫酸镁和氯化钠进行盐析，离心，在所得上清液中加入正己烷，旋涡振荡，除脂；
（3）、对盐析、除脂后的样品进行净化、浓缩、复溶，将盐析、除脂后的样品离心，在所得的下层乙腈层加入C18(十八烷基硅烷键合硅胶)和硫酸镁旋涡振荡进行净化，离心，对所得上清液进行真空浓缩后，先用甲醇对残渣复溶，再用水对剩余的残渣复溶，合并两次复溶所得的复溶液，进行滤膜过滤，得样品分析液；
（4）、利用超高效液相色谱串联质谱方法检测样品分析液中的多种霉菌毒素。
其中：步骤（1）中的含酸的不同浓度的乙腈-水溶液为含0.1%(体积比)甲酸的乙腈-水溶液，不同浓度的乙腈-水溶液为体积比为70-90：30-10的乙腈-水溶液和体积比为10-40：90-60的乙腈-水溶液，不同浓度的乙腈-水溶液为体积比为80：20的乙腈-水溶液和体积比为20：80的乙腈-水溶液。
步骤（2）中的盐析、除脂包括：在样品提取液中加入硫 酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠进行盐析，离心，在所得上清液中加入正己烷，旋涡振荡，除脂。
本文涉及的测试分析设备是：Agilent1290超高效液相色谱仪（配有四元 泵；脱气机和自动进样器），6460质谱检测器（配有电喷雾离子源）。
4 食品中霉菌检测方法的工作原理
食品中霉菌检测方法的工作原理为：在正离子模式下，食品中可检出的霉菌毒素包括：新茄病镰刀 菌烯醇(NEO)、黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2）、伏马毒素（FB1、FB2、FB3）、二乙酰蔗草镰刀菌烯醇(DAS)、杂色曲霉（ST）、HT2毒素（HT2）、胶霉毒素(GLT)、T2毒素（T2）、烟曲霉素(FUM)。在负离子模式下，食品中可检出的霉菌毒素包括：疣孢漆斑菌原（VER）、赭曲霉A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脱氧镰刀雪腐菌烯醇（DON）、镰刀菌烯酮（FUS-X）、去环氧-脱氧 镰刀雪腐菌烯醇（DOM-1）、霉酚酸（MPA）、微囊藻毒素（PAX）、3-乙酰基脱氧镰刀雪腐菌烯醇（3-ADON）、15-乙酰基脱氧镰刀雪腐菌烯醇（15-ADON）霉菌毒素采用多反应监控模式（MRM）对毒素进行定性和定量。根据欧盟关于分析方法要求的法令2002/657/EU，采用液相色谱质 谱方法分析，必须达到4分的要求，本方法选择1个母离子（2分），2个子离子（1分）对目标化合物进行定性，满足了4分的要求。定量方式采用了基质曲线定量，每条曲线由5个点构成，线性相关系数（r2）大于0.995，满足了定量的要求。
5 结语
本食品中霉菌检测方法采用改进的QuEChERS方法对食品进行前处理后，利用超高效液相色谱串联质谱法对提取出的26种霉菌毒素同时进行检测。 用含酸的不同浓度的乙腈水溶液对样品进行两次提取，对样品提取液进行盐析、除脂、净化、浓缩、复溶，利用高效液相色谱串联质谱的多反应监测模式进行检测，提高了检测效率，节省了检测成本，灵敏度高，重复性好，加标回收率高，同时可以扩展到其他高脂含量样品的检测。
参考文献
[1] 许杨. 食品中霉菌抗原及其检测的研究进展[J]. 微生物学通报，1999.
[2] 韩涛、杨雪妮、张芳. 霉菌检测中封闭式培养方法的建立和应用[J]. 食品科学，2019.
[3] 汪琦. 食品中霉菌检测两种方法的比较[J]. 中国误诊学杂志，2004.
[4] 林晓娜. 基于智舌的食品中霉菌快速检测体系构建[J]. 浙江工商大学，2015.
作者简介：黄丽君，女，1978年12月，单位：广西贵港市检验检测中心微生物检验科，助理工程师，研究方向：食品中霉菌的研究。