摘要：目的：研究阿尔茨海默病（AD）病理改变与相关蛋白凋亡的相关性。方法： 以16只健康雄性清洁级P8品系快速老化小鼠（SAMP8）作为研究样本，将样本随机分为I、II 2组各8只。对两组均进行水迷宫实验，初次水迷宫实验之后对I组小鼠腹腔注射0batoclax，对II组注射等量的生理盐水，重复初次实验方法并记录潜伏期和穿越平台次数。二次水迷宫实验后对小鼠进行免疫组化染色，记录两组积分光密度（IOD）值和阳性细胞计数。结果：第二次水迷宫实验中I组潜伏期明显长于II组，穿越平台次数明显少于II组，I组B淋巴细胞瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白的阳性细胞计数明显多于II组，对比差异具有显著性（P＜0.01）；两组异常磷酸化tau（p-tau）蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的阳性细胞计数和IOD值对比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：Bcl-2蛋白是认知变化过程的关键成分，而p-tau、Caspase-3可能并非记忆力减退的作用途径。
关键词：阿尔茨海默病；病理改变；相关蛋白凋亡；相关性
AD是一种神经系统退行性疾病，具有起病隐匿、进行性发展等特点[1]。发病后患者出现全面性痴呆表现，包括记忆障碍、失语、失认、失用、视空间技能障碍、人格行为改变等。截至目前临床尚未明确AD的病因。鉴于此本文拟通过动物实验（SAMP8小鼠的脑部病理、学习记忆衰退类似于AD[2]）研究相关性蛋白p-tau蛋白、Bcl-2蛋白、Caspase-3蛋白凋亡与AD的病理改变的相关性，现报道如下。
1 材料和方法
1.1实验动物
以16只健康雄性清洁级SAMP8小鼠作为研究样本，小鼠无特定病原体级动物环境适应性饲养1周后将样本随机分为I、II 2组各8只。I组为药物组，II组为假治疗组。
1.2 方法
（1）水迷宫实验：将定向航行小鼠面向小鼠Morris水迷宫仪壁随机取起始位置，记录潜伏期（小鼠找到水下平台随需时间）。第1-2d采用可视平台训练；第3-5d选择隐蔽平台进行定向航行；第6d去平台进行空间探索（原象限对侧入水）。采用图像分析仪采集分析试验过程小鼠的游泳轨迹并记录进入目标象限的次数。初次水迷宫实验之后对I组小鼠腹腔注射0batoclax（Bcl-2拮抗剂） 3mg/（kg·d），每日1次，连续两周，对II组注射等量的生理盐水，重复初次实验方法并采集数据。
（2）免疫组化染色：第二次水迷宫实验后对小鼠行灌注处理，并取脑及切片行免疫组化染色，4℃一抗Bcl-2（1：200）、p-tau蛋白（1:80）、Caspase-3（1:100）过夜。二抗IgG室温孵育20min，采用二氨基联苯胺法进行免疫组化染色。每个标本取5片切片判读结果，利用400×高倍镜观察海马区5个不重叠的视野并拍照，记录棕黄色（阳性）细胞数，同时利用图像分析仪测定IOD（IOD=area×平均光密度）。
1.3统计学方法
应用SPSS19.0软件行数据分析，计量资料（）行t检验，临界值α=0.05，若检验值P＜0.05（0.01）即差异具有统计学意义（显著性）。
2结果
2.1水迷宫实验
第二次水迷宫实验中I组潜伏期明显长于II组，穿越平台次数明显少于II组，对比差异具有显著性，P＜0.01，见表1。
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2.2免疫组化染色结果
I组表达的Bcl-2阳性细胞计数明显增加，对比差异具有显著性，P＜0.01。两组表达的p-tau、Caspase-3阳性细胞计数和IOD值比较差异均不具有统计学意义，详见表2。
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3讨论
AD是严重的医学与社会问题，患病后出现进行性认知功能损害，严重影响患者的身心健康与生存质量[3]。
AD神经元（尤其是海马区）丢失中细胞凋亡发挥着中药作用[4]。Bcl-2蛋白是一种细胞膜内蛋白与凋亡密切相关，能够发挥抑制凋亡联级反应的作用。本研究在第二次水迷宫实验对I组注射Obatoclax后，I组潜伏期明显长于II组，穿越平台次数明显少于II组。提示小鼠的学习和记忆能力进一步减退，反映出Bcl-2蛋白抑制剂具有加速老化的作用。表2可知I组Bcl-2蛋白的阳性细胞计数明显多于II组（P＜0.01）；其可能的原因为Obatoclax（拟BH3结构）与Bcl-2结合促使其中BH3结构丧失活性而抑制抗凋亡功能，用药后可能促使Bcl-2与Bax/Bak聚合体解聚从而使得Bcl-2水平一过性增高。Caspase-3是不如细胞凋亡中的关键酶，与Bcl-2蛋白均为神经元凋亡的关键角色。Bcl-2蛋白是Caspase-3的直接底物。p-tau蛋白形成双螺旋是AD神经元退化的基础。Bcl-2具有抑制Caspase-3活性，阻止p-tau蛋白形成双螺旋，减缓AD进展等作用。可见这些蛋白之间存在着复杂联系。本研究中发现相较于II组，I组的p-tau蛋白、Caspase-3的阳性细胞计数和IOD值对比差异无统计学意义。推测其可能的原因为Bcl-2位于这两种蛋白下游，后通过独立作用发挥作用，与温世荣等[6]的报道相符。当然，本实验具有一定的局限性，例如样本数偏小，未设置不同月龄SAMP8进行对比等，未来仍需大样本、多组实验进一步验证。
综上所述，Bcl-2蛋白是认知变化过程的关键成分，而p-tau、Caspase-3可能并非记忆力减退的作用途径。
参考文献
[1]吴志英,陶青青.关注原发性衰老相关性tau蛋白病[J]中华神经科杂志,2019,52(10):793-796.
[2]冯安琪,刘楠,朴美花,等.异氟醚对缺锌APP/PS1转基因阿尔茨海默病模型小鼠海马神经元凋亡的影响[J].吉林大学学报(医学版),2018,44(1):24-29.
[3]罗静,赵艳,谢婧雯,等.敲低SORL1表达构建模拟阿尔茨海默病的细胞模型[J].南方医科大学学报,2018,1(1):8-13.
[4]郑乃智,王敏,赵娟,等.β淀粉样蛋白与癫(癎)合并阿尔茨海默病大鼠模型的神经网络和病理学相关性研究[J].中国临床神经科学,2019,27(3):252-258.
[5]温世荣,于艳红,王德生,等.凋亡相关蛋白在阿尔茨海默病病理改变中的作用[J].中国医药导报,2019(25).
作者简介：李冠冲，男，1992年生，硕士，齐鲁医药学院 人体解剖学教研室教师。