宋人杰 黄皆竣 莫静燕 景亚萍
（扬子江药业集团江苏紫龙药业有限公司；江苏常州213000）
【摘要】目的：延长干热工器具灭菌后存放时限，灭菌结束存放3天延长为7天方法。方法：按照根据2010年药品GMP指南中规定“如果程序用于去除热原，要对其去除热原效果进行验证”，选用合格鲎试剂开展工器具灭菌效期验证。结果：使用灵敏度λ=0.015EU/ml的鲎试剂对干热后存放0天、3天、7天、8天的工器具检测内毒素含量，结果均小于0.015EU/ml，符合规定。结论：工器具干热灭菌效期可延长至7天是可行的。
【关键词】 工器具；干热灭菌；效期验证
Research on the validation of the expiration date of dry heat sterilization
LI Meng-yun*, MO Jing-yan, HUANG Jie-jun
Quality Inspection, Jiangsu Zilong Pharmaceutical Co., Ltd of Yangtze River Pharmaceutical Group, Jiangsu Changzhou 213000
ABSTRACT Objective: Extend the storage time of dry heat industrial equipment after sterilization. Methods: According to the stipulations in the 2010 Pharmaceutical GMP Guidelines “If the procedure is used to remove pyrogens, the pyrogen removal effect shall be verified”, and qualified limulus reagents shall be used for the validation of the sterilization validity period..Results: Use the Limulus reagent with sensitivity λ=0.015EU/ml to test the endotoxin content of the tools and tools stored for 0 days, 3 days, 7 days and 8 days after dry heat. The results are all less than 0.015EU/ml, which meets the regulations. Conclusion: It is feasible to extend the period of dry heat sterilization of tools to 7 days.
KEY WORDS Tools; Dry heat sterilization;Validity verification
干热灭菌是指将物品置于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中，利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原的方法。干热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列过密，以保证灭菌的有效性和均一性[1]。为了满足法规符合性，根据2010年药品GMP指南中规定“如果程序用于去除热原，要对其去除热原效果进行验证”[2]，查询相关文献及期刊时，多为设备及无菌项目的验证方向，工器具内毒素方向的验证鲜有见闻，建立干热灭菌效期的验证方法，为药品生产和检验监督提供一个可行有效的方法参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器
1384-A2型生物安全柜；GCS干热灭菌柜；ET-96内毒素凝胶法测定仪；ZH-2振荡混匀器。
1.1.2 试剂
鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司，批号：1910160，灵敏度：0.015EU/ml）；细菌内毒素检查用水（湛江安度斯生物有限公司，批号：1912200）；内毒素工作标准品150601-201987。
1.1.3 工器具
锥形瓶250ml，广口瓶250ml，试管，取样勺。
2 方法
2.1 细菌内毒素限制(L)确定
根据2015版《中国药典》1143，细菌内毒素检查（BET）用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法），且对内毒素试验无干扰作用。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适应方法[3]。
本次验证用工器具均经过250℃ 30分钟灭菌，验证方法采用将BET水加入待测工器具中，振荡，作为供试液，因此，限值定为每1ml供试液中含内毒素的量应小于0.015EU，使用0.015EU/ml的鲎试剂进行验证。
2.2 试验
2.2.1 MVD的计算
MVD最大有效稀释倍数是实验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，根据MVD=cL/λ，L为0.015EU/ml，c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，λ为0.015EU/ml的鲎试剂灵敏度，因此，MVD值为1倍。
2.2.2 供试品溶液A的制备
玻璃类：取干热灭菌后锥形瓶250ml、广口瓶250ml一只，加入100ml BET水；取试管1支，加入5ml BET水；不锈钢类：取样勺1只，置于无热原的试管中，加入适量BET水（以没过不锈钢取样勺为宜），均需振荡5min，作为供试液。
2.2.3 供试品阳性B的制备：使用近似法
用供试液的1.8ml与0.2ml的20λ混合的方法，制备含有2λ浓度内毒素的供试品溶液。
2.2.4 溶液C的制备
取细菌内毒素工作标准品一支，加入BET水1ml，复溶后置漩涡混合器上混匀15min，梯度稀释至4λ浓度的内毒素溶液。
2.2.5 阴性对照溶液D的制备
加入0.1ml BET水
2.2.6每批样品取20支鲎试剂，先用0.1ml BET水复溶，再按下列方式加入溶液0.1ml。
溶液制备见表1。
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表1 溶液的制备
2.2.7试验结果
结果见表2
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从表2可知，使用λ=0.015EU/ml的鲎试剂对干热后存放0、3、7、8天的工器具检测内毒素含量，溶液B、C平行管均为阳性，溶液D平行管都为阴性，试验有效；溶液A平行管均为阴性，表明干热后的工器具在该存放有效期内符合规定，干热后的工器具存放8天内符合实验要求，因此，工器具干热灭菌效期可延长至7天。
3. 讨论
药品生产的各个环节对内毒素含量有不同的要求，适当包装、正确放置的玻璃器皿，能保证内毒素含量符合要求。为证明存放7天数据的可靠性，对存放0、3、7、8天的工器具检测内毒素含量，当验证研究结束后必须对所有数据进行分析，确定所有试验要求均已达到，并对验证试验中的例外作出解释[4]，证明内毒素含量符合规定。由于灭菌物品的热原大都在高温下才能分解，因此干热灭菌法为一些物品灭菌和除去热原的首选方法。选250℃、30min的干热灭菌法能够除去热原，用此温度能长久保存玻璃器皿，但器皿包装合适，灭菌时排列不可过密，因为干热灭菌热穿透能力差，温度均匀性较差[5]。
本实验结果表明，经干热灭菌（250℃，30min）后取样用玻璃器皿在规定条件（包一层铝箔，放置干热灭菌柜内）下放置7天，内毒素含量符合规定，可放心使用，若改变包装形式需重新进行验证。
参考文献
[1]李传秋,王磊,张丽,等.玻璃器皿在干热灭菌后存放时间的验证[J].食品与药品,2007(08):34-35.
[2]国家食品药品监督管理局药品认证管理中心. 药典GMP指南:质量控制实验室与物料系统[S].中国医药科技出版社,2011.8:236.
[3]国家药典委员会. 中华人民共和国药典：四部[S]. 北京：中国医药科技出版社, 2015:1143.
[4]张则敬.干热灭菌和去热原的验证[J].上海医药,1997(03):36-37.
[5]周建华,赵春晖,赵春燕.干热灭菌及其在制药工业中的应用[J].安徽医药,2004,8(4):304-305.