摘要：本研究采用聚合酶链反应( PCR)扩增出乙型脑炎病毒( JEV) E蛋白基因, 并进一步克隆入原核表达载体pMBP-C, 经测序验证无误后转化大肠杆菌BL21 Gold表达乙型脑炎病毒E 蛋白。经异丙基巯基半乳糖( IPTG)诱导表达后, 采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)分析表达产物，表达量约占菌体上清液总蛋白的40 %，分析证实确为乙型脑炎病毒E蛋白且有生物学活性。本研究为实验室制备乙型脑炎病毒E蛋白诊断抗原和为今后研制乙脑分子诊断试剂盒和基因工程疫苗打下了基础。
关键词：脑炎病毒； E 蛋白；基因表达；大肠杆菌；优化
流行性乙型脑炎(乙脑)病原体为乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)， 简称乙脑病毒，又称日本脑炎病毒[1]。乙脑病毒经蚊子(库蚊、伊蚊等)叮咬后在禽畜和人类之间相互传播（有报道认为蠓、螨、蝙蝠也可能是传播媒介)。该病主要流行于远东及东南亚, 每年导致约50000 人患病, 其中约10000人死亡。而我国作为乙脑发病人数最多的国家, 年发病数大概1万例。研究发现，JEV有3种结构蛋白：核衣壳蛋白(C)、膜蛋白(prM/M)、囊膜糖蛋白(E)；7个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5)[2]。E蛋白为JEV的主要结构蛋白, 含500 个氨基酸残基，其分子量约为53kDa。作为病毒粒子表面最重要的结构成份，E蛋白是主要的毒力抗原，参与病毒复制的许多过程，包括结合受体、膜融合和毒粒包装等[3,4]。因此，人们一直以来重点研究E蛋白。过往研究发现，E蛋白含有3个抗原域：域Ⅰ包含130个氨基酸残基, 拥有血清学及生物活性的抗原表位；域Ⅱ包括181个氨基酸残基，具有中和活性和血凝活性的抗原表位；域Ⅲ包括100 个氨基酸残基, 参与受体结合过程[5,6]。
实验室检测患者血清中JEV IgM抗体是非常重要的诊断方法。因此，利用基因工程重组技术表达的JEVE蛋白抗原因为可以低成本大规模表达和纯化而有望成为标准化的诊断抗原。此外，E蛋白的正确折叠和组装对能否诱发特异性中和抗体的产生至关重要。近年来，大肠杆菌[7,8]和毕赤酵母表达系统[9], 已多次成功用于E蛋白的异源表达并检测到生物活性。为了高效分析大肠杆菌表达的E蛋白的生物学特性, 建立简便、快速的乙脑实验室诊断方法, 我们将JEVE蛋白在大肠杆菌中进行了融合表达和纯化，并分析其生物学活性。
1 材料与方法
1.1菌株和质粒
大肠杆菌DH5和BL21 Gold在本实验室保存。乙型脑炎病毒减毒活疫苗由本实验室提供。质粒pUCm-T和pMBP-C购自深圳派动力生物技术开发公司。
1.2工具酶及主要试剂
限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司。DNA快速回收试剂盒购自Qiagen Sciences公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 引物的设计
根据GenBank 中已报道的JEV-SA-14-14-2株核苷酸序列[10]设计合成乙脑病毒E蛋白基因引物。上游引物: 5’-CGGAATTCTTTAATTGTCTGGGAATGG -3’；下游引物: 5’-CCGCTAGCAGCTAGCACATTGGTCGCTAA-3’，上、下游引物5’端分别引入EcoRI和NheI酶切位点方便进行分子生物学操作。
1.4 RT-PCR扩增目的基因
1.4.1 减毒活疫苗中提取RNA
每管加100μL样本，再加400μL样本处理液A振荡10秒钟，充分混匀。加100μL三氯甲烷，振荡10秒钟，充分混匀，20000 g离心5分钟，小心吸取上清，转入新管中。再加异丙醇（与上清等体积）充分混匀，20000 g离心10分钟，小心弃上清。加300μL预冷的75%乙醇，颠倒混匀，20000 g离心5分钟，小心吸弃上清，94℃快速烘干。
1.4.2反转录目的基因
取减毒活疫苗中提取的总RNA 3μ g, 用Oligo dT18 引物合成cDNA 第一链。反应体系为: 5 ×反应缓冲液10 μL; RNase 抑制剂1μL; 逆转录酶1 μL; Oligo dT18 引物1 μL; dNTP 2 μL; AMV 逆转录酶1 μL; 加无RNase 的水至总体积50 μL。37 oC 5 min, 42 oC 1 h, 70 oC灭活10min。以合成的cDNA 为模板, 用PyrobestTM DNA polymerase 扩增乙脑病毒E蛋白 DNA 序列。PCR 反应体系为: 乙脑病毒E蛋白cDNA 模板2 μL; 10 ×反应缓冲液5 μL; 乙脑病毒E蛋白基因序列的上下游引物各1 μL; dNTP 4 μL; PyrobestTM DNA polymerase 1μL; 加水至总体积50 μL。PCR 反应条件: 94 oC 30 s, 55 oC 30 s, 72 oC 1 min，共进行30 次循环。0.8% 琼脂糖凝胶电泳分析RT -PCR 扩增产物。
1.5 PCR 产物的克隆鉴定
回收纯化目的DNA片段, 在T4 DNA 连接酶的作用下与PUCm-T 克隆载体连接构建PUCm-JEVE。连接产物转化DH5α 感受态菌, 涂于氨苄青霉抗性的LB平板上, 37 oC过夜培养, 挑取白斑接种于5 mL含氨苄青霉抗性的LB 培养基中, 37 oC培养16 h, 按常规方法小量提取质粒, 然后进行酶切鉴定。
1.6 序列分析 挑选酶切鉴定正确的重组菌, 小量培养, 提取质粒, 由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。利用生物学软件DNAMan对乙脑病毒E蛋白的基因序列和编码氨基酸序列进行分析。
1.7乙脑病毒E蛋白大肠杆菌表达载体的构建
将带有EcoRI和NheI酶切位点的乙脑病毒E蛋白的基因片段双酶切, 纯化回收酶切片段, 同样对pMBP-C 载体进行EcoRI和NheI双酶切纯化回收后,T4连接酶连接, 构建乙脑病毒E蛋白大肠杆菌表达载体pMBP-JEVE, 转化大肠杆菌DH5α , 挑选阳性克隆, 小量提取质粒, 用EcoRI和NheI双酶切鉴定, 并测序确定读码框正确。
1.8 乙脑病毒E蛋白在大肠杆菌中的表达
鉴定正确的pMBP-JEV质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21 Gold, 挑选阳性克隆接种于5 mL含卡那霉素抗性的LB 培养基中, 37 oC振荡培养16 h, 取1 mL 接种于100 mL 含氨苄青霉素抗性的LB 培养基中剧烈振荡培养至OD600 为0.6-0.8, 加入IPTG至0.2 mmol/ L, 16 oC继续诱导16小时, 取菌液1 mL于 12 000 g 离心1 min, 加入1 × SDS 上样缓冲液20 μL,煮沸后离心取上清用SDS- PAGE对表达产物进行鉴定。将其余菌体离心收集后经超声破碎，将上清液利用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化，利用蛋白自带的His6标签进行纯化，并将蛋白纯品用于分析。
1.9表达产物的免疫印迹检测
样品经SDS-PAGE分离后, 用电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜上, 以抗JEV特异性猪抗血清单抗为一抗, 以辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG 为第二抗体，并加以底物溶液显色。按照文献[ 11] 的方法进行蛋白免疫印迹检测。
2 结果与讨论
2.1 PCR扩增产物的鉴定结果：
由电泳图（图1）可知，以引物1和引物2在上述条件下扩增，得到了一条1500bp的DNA目的条带，与目的条带大小相符。
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图1. JEV E基因的PCR扩增结果
Fig.1. The PCR product of JEV E
M.Marker (DL2000) 1. Amplified 1.5 kb DNA fragment coding E gene of JEV
2.2阳性重组质粒pUCm-T/JEVE的鉴定
为初步确定基因片段是否正确，将质粒进行双酶切验证，电泳结果如图2所示：pUCm-T-JEVE 质粒切出一条1500 bp左右的条带，与PCR产物大小一致，证明基因JEVE成功重组到质粒pUCm-T上面。经测序验证，序列与报道序列100%一致[10]。
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图2克隆质粒pUCm-T-JEVE的酶切鉴定
Fig.2 Identification of plasmid pUCm-T-JEVE
M. Marker (DL15000) 1. pUCm-T-JEVE digested by EcoRⅠ and NheI 2. PCR product of JEV E
2.3阳性重组质粒pMBP-JEVE的鉴定
如图3所示，利用EcoRI和NheI对质粒pMBP-JEVE进行双酶切处理后，可明显看到E蛋白基因的小片段和一载体大片段，证明E蛋白基因已经正确重组到质粒pMBP-C上。经测序验证，序列无突变，可以进行下一步实验进行蛋白表达。
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图5重组表达质粒pMBP-JEVE的酶切鉴定
Fig.5 Restriction analysis of recombinant expression plasmid pMBP-JEVE 1.Marker ( DL15000) 2. pMBP-JEVE digested by EcoR Ⅰ and NheI
2.4诱导表达产物的纯化及鉴定
本实验所表达的E抗原准备做诊断试剂用，故需要较高的纯度，尽量降低杂蛋白的含量，由于该蛋白在大肠杆菌中可溶性表达有些困难，本次试验采用能进行融合蛋白表达的质粒pMBP-C。pMBP-C表达载体采用E. coil tac强启动子和胞内可溶性麦芽糖结合蛋白(MBP，42.5 kDa)提高蛋白表达量和可溶性，可与E蛋白进行融合表达提高其水溶性而有利于纯化。将未诱导的菌体、诱导过的重组pMBP-JEVE大肠杆菌菌体破碎后分别取上清进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图4所示：与对照菌相比，诱导菌的破碎上清液出现了一条特异带，初步判断为目的蛋白，而且表达量不低，大概占上清中总蛋白量的40%。本实验所采用的高效表达系统所表达的蛋白含有His6序列以便于纯化。pMBP-C载体在C端添加6个His，故采用镍亲和层析柱进行纯化。目的蛋白吸附到镍柱上，而无His序列的蛋白则无法吸附，被起始缓冲液洗脱，咪唑与His结构类似可与目的蛋白竞争与镍柱结合，将目的蛋白洗出。SDS-PAGE分析结果显示，目的蛋白是一条比较纯的条带。对纯化后的表达产物进行Western印迹分析, 结果E蛋白在95 kDa附近出现一条很浓的特异性带, 而对照为阴性。结果说明该表达产物具有很强的特异性和生物活性, 而且血清中存在大量特异性针对E蛋白的抗体。
目前，在大肠杆菌中表达E蛋白，主要是通过与一些蛋白标签比如GST、 Trx等来促进蛋白水溶性表达。徐高原等[12]将E蛋白基因重组到原核表达载体pGEX-KG中, 转化大肠杆菌BL21(DE3) 表达与GST蛋白标签融合蛋白。表达的目的蛋白经SDS -PAGE和Western blotting分析证实确为乙型脑炎病毒E蛋白且有生物学活性。Fan et al.[10]利用原核表达载体pET32a 构建了E蛋白表达系统，通过载体自带的Trx标签高效表达了分离自Henan-09-03病毒株的E蛋白融合蛋白。研究发现稳定表达的E蛋白特异性抗原分析可以为开发ELISA早期诊断试剂盒奠定基础。此外，毕赤酵母表达系统由于具有营养要求低、内源性蛋白分泌少、高密度生长及蛋白糖基化适中等优点,适合病毒糖蛋白表达。吴玉水等[9]采用巴斯德毕赤酵母系统表达乙型脑炎病毒E蛋白，将JEV E蛋白基因亚克隆入真核表达载体pPIC9K后用电转化法转化酵母SMD1168。并且采用G418 筛选高拷贝转化子, 经甲醇诱导表达后, 利用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。发现由于糖基化不同, 所表达产物的相对分子质量(Mw)分别约为78 kDa和113 kDa, 为制备JEV的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础。
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图4 SDS-PAGE分析大肠杆菌表达的E蛋白
Fig.4 Expression of the recombinant E protein in E.coli analyzed by SDS-PAGE. M. Marker 1.pMBP-JEVE( uninduced) 2.pMBP-JEVE (induced) 3. purified E protein.
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图5 E蛋白的免疫印迹分析
Fig.5 Western blot analysis of expression recombinant E protein
1.pMBP-JEVE( uninduced) 2.pMBP-JEVE (induced) 3. purified E protein
3 结论
本实验应用RT-PCR成功地扩增出E蛋白基因片段。利用高效表达载体成功地构建了含有E蛋白基因片段的重组质粒。将含有E蛋白基因片段的重组质粒转入相应的E. coli（BL21 Gold)菌株中，成功地构建了可融合表达E蛋白基因的工程菌。电泳鉴定发现E蛋白实现了水溶性表达，经过纯化后得到了高纯度的目的蛋白。综上所述，可融合表达E蛋白的工程菌的成功构建及目的蛋白的高效纯化使得其可以低成本大规模表达和纯化而有望成为标准化的诊断抗原，为将来利用基因工程生产乙脑疫苗奠定了基础。
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作者简介：刘占（1982－ ），性别：女，民族：汉，学位，本科，专业技术职称：助理工程师；研究方向：生物技术