摘要：目的 分离培养经血来源间充质干细胞(Menstrual Blood-Derived Mesenchymal Stem Cells，MenMSCs)，检测胚胎干细胞转录因子(octamer-binding transcriptionfactor- 4，Oct4）的表达。方法 通过密度梯度离心和差速帖壁法分离间充质干细胞，体外传代培养，通过倒置相差显微镜观察细胞的粘附、生长情况。取对数生长期的细胞在酶标仪450nm波长处检测吸光度值，绘制细胞生长曲线，有限稀释法观察克隆形成，免疫细胞化学方法检测干细胞表面标志的表达。结果 经血间充质干细胞在体外培养体系中增殖迅速，免疫细胞化学染色Oct4、CD44阳性。结论 经血间充质干细胞增殖能力强，具有成体干细胞和胚胎干细胞的特性。
关键词：经血；细胞培养；间充质干细胞；生物学特性
Isolation and Characteristies of Menstrual Blood-Derived mesenchymal Stem Cells
ZHANG Ke-rong1, CHANG Xiu-mei2
Department of gynaecology and obstetrics and Reproductive medicine, Second Clinical Medical College of Guangdong Medical university, Guangdong, Dongguan 523808, China;2. Department of Stomatology,Second Clinical Medical College of Guangdong Medical university, Guangdong, Dongguan 523808)
Abstract Objective To investigate the possiblity of isolating mesenchymal stem cells from Menstrual Blood Methods Menstrual Blood was obtained by women. The cells isolated from the Menstrual Blood were cultured in 10% FBS. Growth curve of Menstrual Blood-derived mesenehymal stem cells were drawn. The cultured cells were identified by its morphological and combined with immunos-taining for expressionCD34、CD44、Oct4. Results The cultured human Menstrual Blood mesenehymal Stem Cells were typical fibroblast cells in shape. OCT4 and CD44 were present in Menstrual Blood mesenehymal stem cells. Conclusion The cells cultured in our research from Menstrual Blood mesenchymal Stem Cells, it hold a promise for repair and regeneration of lost or damaged tissues primarily due to their two distinctive features: embryonic stem cells (ESCs) and adult stem cells.
Key Words: Menstrual Blood; Cell culture; mesenehymal stem cell from Menstrual Blood; biological character
子宫内膜呈周期性增殖变化，有学者早已预言一定有干细胞参与这一过程。目前，子宫内膜干细胞的研究报道越来越多，研究证实月经周期子宫内膜组织各个时期中均具有增殖和分化特性的活细胞[1-5]，如分泌期子宫内膜组织、早孕蜕膜组织和月经血中。经期脱落子宫内膜干细胞因容易获得，不需要复杂手术取材，不受伦理限制等诸多优势，引起广泛关注。但对经血中细胞的来源、成分、培养方法，仍然没有统一的标准和定论[6-14]。课题组从年轻健康育龄妇女月经中分离干扩增间充质细胞，并检测其干细胞特性，为今后的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
DMEM 培养液、胎牛血清、胶原酶、胰蛋白酶 (Gibco，美国)，鼠抗人多克隆抗体CD44、Oct4（Santa Cruz公司），超净工作台(苏州净安泰空气技术有限公司)，CO2 孵箱(Heraeus，德国)，倒置相差显微镜照相系统（Olympus，日本)，流式细胞仪 (FACSCalibur，美国)，高速离心机（KUBOI，AKR/7OZJ，日本）。
1.1.2标本来源：经血样本来源于年龄在18-35岁健康、无不良嗜好的健康女性志愿者，提供前需签署知情同意书。
1.2 MenMSCs的分离与原代培养
将0.2 ml 1%青霉素/链霉素(Sigma)和0.1 ml EDTA-Na2 (Sigma)分别加入含有30 ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)的50 ml锥形管中。月经采集由捐献者完成，首先将无菌的Diva杯插入阴道，放置30-60分钟取出，将Diva杯的内容物倒入收集管并送往实验室。经血标本在室温下 1100 r/min离心 5 min，取上部，加入0.25%胶原酶2ml，静置于5%CO2、95%湿度、37℃细胞培养箱消化20min后， 1000 r/min离心5 min，加入 20 ml L-DMEM培养液(含 10％ 胎牛血清)、制成单细胞悬液，接种到培养皿中置饱和湿度、5％CO2 、37℃培养箱培养。接种第4 d换液。倒置相差显微镜每日观察细胞形态，每日更换培养液，待细胞约达90%融合时进行1:3传代培养。
1.3 MenMSCs的生长曲线测定
取 90％融合的第10代MenMSCs制备单细胞悬液，调整细胞浓度为2×104个/ml，接种于 24孔培养板，每孔0.5 ml，置培养箱培养，每2 d更换培养液。从第2 d起每隔24 h随机取3孔细胞计数，取其平均值作为当天的细胞数，绘制8 d的细胞生长曲线。计算细胞倍增时间[TD=t×lg2/lg(N1／N0)]( N1为 t时间的细胞数，N0为初种细胞数)。
1.4 MenMSCs克隆形成率检测
取第10代细胞制备单细胞悬液，接种至预置滋养层的96孔板，3-4 d换液一次，培养5w后，吸弃培养液，PBS洗3次，甲醛固定15min，Giemsa染色20-30min，流水缓慢冲洗染色液，空气干燥，克隆计数和克隆形成率计算。
1.5免疫组织化学检测表面抗原检测
取 90％融合的不同时期MenMSCs，PBS洗涤后制备细胞爬片，分别加入小鼠抗人抗体：Oct-4、CD34、 CD44，设立阴性对照，用免疫组织化学检测。
1.6 MenMSCs细胞周期检测
取不同时期生长良好的MenMSCS，制备单细胞悬液，用流式细胞仪检测细胞周期。
2 结果
2.1 MenMSCs的分离和培养
接种第2 d，即可见有散在的贴壁细胞，大多呈梭形或针尖状，部分呈多角型和圆形，5 d 后，形成以散在的梭形细胞为主，类成纤维细胞的集落和多角型铺路石样的上皮细胞，利用成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，多次差别消化法进行纯化后，上皮样细胞明显减少，传代的间充质细胞仍然克隆化生长，随着细胞增殖，集落融合，之后成漩涡状生长，传至10代细胞仍保持短梭型，形态不变(图1，2) 。
2.2 MenMSCs生长曲线
MenMSCs生长曲线呈S形，接种后 1～2 d为潜伏适应期 ，从第 3 d起进入对数生长期，第 7 d达到高峰，以后进入平台期群体伴倍增时间为28 h ( 表1)。
2.3 MenMSCs的表面抗原特性
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5份样本重复测定，结果MenMSCs表达Oct-4、CD44，而 D34阴性，不同样本间差异无统计学意义，不同代细胞间表现相同（图3，4）。
2.4 MenMSCs细胞克隆形成率
低密度种植 6d后，可形成散在的细胞集落，6个标本第1代集落形成率平均为 25％，第3代均为23%，5代平均为20％，随传代次数增加集落形成率有逐渐降低的趋势。
2.5 MenMSCs细胞周期检测
流式细胞仪检测结果显示第3代细胞G1、S、G2期的细胞所占百分比分别为71.36%、5.49%、23.15%。
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表1 第10代MenMSCs的生长曲线
Table 1 The growth curve of the tenth passage of MenMSCs
3 讨论
子宫内膜由上皮、 腺体和基质组成。青春期后，子宫内膜随卵巢分泌的雌激素的周期性变化而周期性的增殖和崩解脱落，这种周期性增殖、剥脱提示子宫内膜组织中有增殖活性的干细胞群落存在。月经血是子宫内膜组织剥落形成，经血中必然存在子宫内膜功能层的活组织和细胞。目前的研究证实，正常子宫内膜组织、早孕蜕膜组织和月经脱落的子宫内膜中均含有具有增殖和分化能力的干细胞，但对细胞的来源和特性并无定论。有研究认为子宫内膜中的干细胞来自血循环中的骨髓干细胞[6]，另外有研究发现这些细胞表达胚胎干细胞特有的Oct4[7-9]，认为子宫内膜中的干细胞由残存的胚胎干细胞发育而来。
为明确子宫内膜中的细胞来源和特性，增殖的子宫内膜组织是否是一种比较原始的具有多种分化能力的全能干细胞分化而来？我们对分离的间充质样细胞进行CD44和Oct4免疫化学染色，结果发现有Oct-4阳性细胞。这与Patel 团队[7]的研究结果一致。Oct-4为八聚体结合转录因子-4，是胚胎干细胞中重要的转录因子，在维持胚胎干细胞的多能性和自我更新能力方面发挥着举足轻重的作用，控制干细胞维持未分化状态，是决定干细胞多能性和自我更新能力的关键物质[14]。Oct-4的存在是明确细胞为全能干细胞的重要标志之一，MenMSCs细胞中存在Oct-4阳性细胞的事实提示，子宫内膜形成过程中有更原始、增殖和分化能力更强、更接近于胚胎干细胞的细胞参与。相对于成体干细胞取材不易、增殖能力较弱和分化方向局限的缺点，经血来源Oct-4阳性的干细胞具有更广阔的研究前景。对其分离、进一步的纯化和建系将为多能干细胞开辟新的来源，从而能够避开胚胎干细胞研究所面临的伦理学问题。MenMSCs免疫细胞化学染色CD44阳性，这是间充质干细胞和神经干细胞的表面标志[10-12]，而在胚胎干细胞中不表达；因此MenMSCs可能是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的一种过渡阶段的干细胞。可以在适宜条件下向其他胚层细胞分化[15-20，22-23]，细胞免疫细胞化学染色，CD34无表达，表面无造血干细胞存在，与文献报道间充质干细胞的染色和表面标记的特点一致。
本研究中，我们利用密度梯度离心法去除月经中的血细胞，获得有核细胞团块和脱落内膜，将组织团消化30 min，接种48h后可见贴壁细胞，细胞形态以纺锤形为主，有少量多角形的类上皮细胞，纺锤形细胞增殖速度明细快于上皮样细胞，脱落组织块中的细胞贴壁，原代在帖壁分离法的基础上，根据细胞形态，在传代培养时利用间充质细胞与上皮细胞对胰酶的耐受性不同将间充质细胞纯化，对其进行单独培养。该方法成功分离培养具有贴壁特性的间充质细胞，经传代获得具有高度增殖活力的间充质干细胞。该方法操作简单、易于掌握、不需特殊试剂和器材，获得的细胞具有自我纯化特性，传至第2代接近融合时细胞形态呈纤维细胞群，与其它来源间充质干细胞相似。细胞接种后3d，可见少量的贴壁细胞，形态以短梭形为主，有多角形上皮细胞形态的细胞。传代培养的细胞形态逐渐均一，以梭形细胞为主，生长迅速，平均倍增时间约为28 h。细胞周期检测结果表明，细胞的增殖能力强，大部分细胞处于G1期，符合干细胞的特点。
Zimmermann等[21]发现间充质干细胞并不像人们想象的那样可以无限传代，细胞在传代的过程中活力会逐渐丧失，失去研究的应用价值。为此，本研究对10代MenMSCS进行了生长动力学观察。发现细胞生长曲线呈S形，第10代群体倍增时间为28h，表明其符合正常细胞的生长特性。实验中还发现，第10代细胞仍再生活跃。采用流式细胞仪对第10代细胞周期测定的结果显示细胞DNA合成的S期在细胞中所占有的比例较高。集落形成能力测定也显示同样的结果。
我们从年轻健康生育女性月经血分离的间充质干细胞，具有增殖活力，克隆形成能力，同时表达胚胎干细胞和成体干细胞的特有的因子，MenMSCS具有胚胎干细胞特性和成体干细胞的共同特性，且经血来源干细胞来源丰富，不存在伦理问题，是再生医学研究理想的种子细胞。但本研究仅从细胞水平对其进行了初步研，今后还需进一步从分子水平研究其相关因子的表达。
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