摘要：目的 本文采用了薄层色谱法，容量法以及高效液相色谱法对奈立膦酸钠的原料药中的有关物质进行了测定。方法 采用薄层色谱法对奈立膦酸钠的起始原料6-氨基己酸以及磷酸盐杂质的含量进行测定，采用容量法对亚磷酸盐杂质进行研究，原料药中的未知杂质则通过高效液相色谱法进行测定。结果 本实验设计的薄层色谱法检测6-氨基己酸以及磷酸盐含量能够准确分离奈立膦酸钠和杂质，专属性很好，原料药样品中未检出6-氨基己酸以及磷酸盐杂质。容量法检测原料药的亚磷酸盐含量结果显示，该方法专属性、线性、精密度和准确度均满足要求。未知杂质通过高效液相色谱法进行检测，报告显示未有未知杂质检出。
关键词：奈立膦酸钠 有关物质 薄层色谱法 容量法
Methodology study of related substances of Sodium Niledronate active pharmaceutical ingredient
Abstract：Objective The purpose of this study was to determine the related substances in the drug substance of Nasirisodium phosphate with thin layer chromatography, volume method and high performance liquid chromatography. Methods The contents of 6-aminocaproic acid and phosphate were determined by thin-layer chromatography. The impurity of phosphite was determined by volume method. The unknown impurities in the drug substance were determined by high performance liquid chromatography. Results The determination methods of 6-aminocaproic acid and the phosphate substances were proved feasible, and no 6-aminocaproic acid and phosphate impurities were detected in the active pharmaceutical ingredient samples. The results of the determination of the subphosphate content of the active pharmaceutical ingredient by the capacity method show that the method is specific, linear, precise and accurate. The unknown impurities are detected by high performance liquid chromatography and the result shows that no unknown impurities are detected.
Keywords：Sodium Niledronate；related substances；thin layer chromatography; volumetry?
0 前言
奈立膦酸钠（Neridronate Sodium）化学名为6-氨基-1-羟基亚己基-1,1-二膦酸一钠盐，结构式见图一，是一种抑制甲羟戊酸生物合成途径的关键酶（FPP合成酶），能够干扰破骨细胞的骨吸收和成活所必要的一系列细胞功能，[1-4]具有抑制破骨细胞活性，减少骨量流失的作用[5-7]。奈立膦酸钠是由意大利Abiogen Pharma S.P.A.开发一种含氮的双膦酸盐，剂型为注射液，规格为1）2ml：25mg，2）8ml：100mg（按奈立膦酸计），商品名为NERIXIA [8-9]，以复杂性区域疼痛综合征Ⅰ（CRPS-Ⅰ）和成骨不全症（OI）为适应症于2002年在意大利上市[10]，但是各国的药典都没有收载奈立膦酸钠的原料药和制剂的质量标准。
本实验基于对奈立膦酸钠的工艺研究，对其原料药中可能出现的杂质进行监测，包括起始原料6-氨基己酸、磷酸盐、亚磷酸盐以及未知杂质。本文中简要阐述了6-氨基己酸的薄层色谱检测法，磷酸盐的薄层色谱检测法，亚磷酸盐的容量检测法以及检测未知杂质的HPLC法，并对各个检测方法进行方法学验证，期望能为后续的奈立膦酸钠原料药及制剂的杂质检测提供依据。
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图1.奈立膦酸钠结构式
Fig1. Chemical structure of Neridronate Sodium
1 仪器与试药
Perkin Elmer 200系列高效液相色谱仪，Perkin Elmer Totalchrom工作站，恒温干燥箱，薄层涂板（20*20cm，0.1mm，无荧光指示剂纤维素）
奈立膦酸钠对照品（），奈立膦酸钠原料药（批号78821,78819），甲醇，乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 6-氨基己酸
精密称取12.5mg的6-氨基己酸，置于100mL量瓶中，然后用水稀释至刻度作为对照品母液，随后从母液中取出1ml到10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为6-氨基己酸对照品溶液。精密称取50mg供试品，在10mL量瓶中溶解，用水稀释至刻度，作为供试品溶液。精密称取50mg奈立膦酸钠，取1mL的对照品母液，转移至10mL量瓶中，用水定容到刻度作为混合溶液。
2.1.1薄层色谱条件
通过TLC法进行检测，采用的试验条件见下表。
表1. TLC法试验条件
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分别将上述的溶液于板上点样：40μL溶液对照品溶液，40μL供试品溶液，40μL混合溶液；展开之后，薄层板置于空气中晾干，喷以含0.2%茚三酮的乙醇溶液，置于100℃中干燥5分钟。6-氨基己酸的对应斑点为紫色，其Rf值约为0.81；奈立膦酸钠的对应斑点为粉红色，其Rf值约为0.38。在供试品溶液色谱图中的6-氨基己酸的对应斑点不得比其在对照品溶液色谱图中更深。混合溶液色谱图显示的6-氨基己酸和奈立膦酸钠的斑点应显示清晰分离。
2.1.2方法验证
2.1.2.1专属性实验
分别按2.1项下供试品溶液配制方法制备不同批次的奈立膦酸钠的水溶液（批号78821,78819）作为供试品溶液，分别将40μL的溶液6-氨基己酸对照品、78821批奈立膦酸钠水溶液、78819批奈立膦酸钠水溶液和混合溶液分别点在薄层板上，保温45℃。让溶剂展开大约15cm，干燥薄层板。对照品溶液和混合溶液点样两次。向薄层板喷以显色剂，并在100℃的通风烘箱中干燥5分钟。实验结果见图2。奈立膦酸钠对照品和样品的Rf值在0.35左右，6-氨基己酸的Rf值在0.72左右，结果显示TLC法能够突出杂质，并能准确分离奈立膦酸钠和杂质，不存在对检测的干扰。样品中未出现可检测到的6-氨基己酸。
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图2. 6-氨基己酸TLC检测方法专属性图谱
Fig2. Specificity chromatograms in the TLC detected 6-aminocaproic acid
2.1.2.2 检测限
用从40μL到5μL逐渐减量的对照品溶液，同时加40μL供试品溶液点样，喷以显色剂，并在100℃的通风烘箱中干燥5分钟。结果显示，TLC法显示6-氨基己酸的检测限为120ng。
2.2 磷酸盐
精密称取50mg奈立膦酸钠原料药及对照品，置于10mL量瓶中，然后用水稀释至刻度，分别作为奈立膦酸钠供试品和对照品溶液。精密移取0.23mL 85%磷酸至100mL量瓶中，用水稀释至刻度。吸取0.5mL此溶液置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，作为磷酸盐对照溶液。
2.2.1 薄层色谱条件
通过TLC法进行检测，采用的试验条件见下表。
表2 TLC法试验条件
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(2) 含1g抗坏血酸的100mL水
分别取上述溶液进行点板：40μL的奈立膦酸钠溶液；40μL奈立膦酸钠对照品溶液和12μL 磷酸盐对照品溶液；12μL的磷酸盐对照品溶液。展开之后，干燥薄层板，喷以显色剂（1），100℃加热5分钟。冷却到室温后喷以显色剂（2）。出现蓝色斑点，其强度随时间增长。反应6小时后，观察薄层板发现，磷酸盐和奈立膦酸钠对照品的对应斑点应清晰分离。
在奈立膦酸钠溶液色谱图中的磷酸盐的对应斑点不得比其在磷酸盐对照品的色谱图中的更大更深。
2.2.2 方法学验证
2.2.2.1 专属性
分别取40μL的奈立膦酸钠溶液；40μL奈立膦酸钠对照品溶液（WS）和12μL 磷酸盐对照品溶液；12μL的磷酸盐对照品溶液点三个点。薄层板保温45℃。让溶液展开大约15cm，在空气中正确干燥薄层板。喷以显色剂（1），并立即将薄层板置于100℃的通风烘箱中干燥5分钟，然后冷却，再喷以显色剂（2）。
磷酸盐检查的TLC法的专属性验证结果见图3，奈立膦酸钠对照品和样品的Rf值约为0.53，磷酸盐的Rf 约为0.75。结果显示TLC法能够突出杂质，并能准确分离奈立膦酸钠和杂质，不存在对检测的干扰，并且样品中未出现可检测到的磷酸盐。
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图3. 磷酸盐TLC检测方法专属性图谱
Fig3. Specificity chromatograms in the TLC detected phosphate
2.2.2.2 检测限
用从12μL到1.5μL逐渐减量的磷酸盐对照溶液同时加40μL供试品溶液点样。喷以显色剂（1），并立即在100℃的通风烘箱中干燥5分钟（避免薄层板触碰到烘箱壁），然后冷却，再喷以显色剂（2）。由结果可知，TLC法显示磷酸盐的检测限为50ng。
2. 3 亚磷酸盐
准确称取3.5g奈立膦酸钠供试品，置于250mL具塞量瓶中，加70mL水。在搅拌的条件下加入20mL缓冲液（准确称量6.9g磷酸二氢钠，溶解在500mL水中，加入400mL 0.1N氢氧化钠配制）；加入25%氢氧化钠，检查pH（使用玻璃电极）至pH达7.3±0.2。向得到的溶液中加入20mL 0.1N I2溶液，停止搅拌，避光静置3小时。用6N乙酸调节pH至4.5±0.2。用0.1N硫代硫酸钠滴定至呈微黄色。然后加入2mL淀粉溶液，继续滴定至蓝色消失。进行空白滴定，从而进行校正。
使用下面的公式计算亚磷酸盐的含量：
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其中：
Vb = 表示空白滴定消耗的0.1N硫代硫酸钠溶液容积(mL)
Vc = 表示样品滴定消耗的0.1N硫代硫酸钠溶液容积(mL)
W = 表示样品的重量，单位用g表示。
2.3.1 方法学验证
2.3.1.1专属性
对6份空白溶液进行分析，以评价方法的专属性。溶液中包含除了奈立膦酸钠原料药外制备样品溶液的所有试剂。空白样品滴定消耗硫代硫酸钠体积的平均值为19.80mL，相对标准偏差（RSD）为0.23%。说明本实验方法专属性良好。
2.3.1.2 QL（定量浓度）测定
确定目标分析物的QL浓度为相对于样品中奈立膦酸钠的理论浓度的0.10%。进行3次独立测定。QL测定的结果显示，在QL水平上，亚磷酸盐的平均回收率为100.1%，RSD值为3.7%。
2.3.1.3 线性
线性评价范围在QL～0.8%的奈立膦酸钠量的理论浓度之间。线性试验的溶液制备见下表。
表3：线性考察的样品配制表
Tab 3. Sample preparation for linear investigation
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检查方法的线性结果见图4，线性回归方程是y=0.071x+0.188，相关系数（R2）为1.000，说明该方法用于检测亚磷酸盐的浓度可行。
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图4. 亚磷酸盐含量标准曲线
Fig 4. Standard curve of phosphite content
2.3.1.4精密度
重复性：取6份独立原料药样品进行含量测定。如果亚磷酸盐量低于估算的QL，那么样品中加入29.08mg NaH2PO3·5H2O（相当于0.4%）。
中间精密度：第二个分析员在不同日期对相同的批次原料药重复进行精密度试验。
精密度试验中得到的两组亚磷酸盐回收率数据无统计学差异，应用单因素ANOVA检验（p=0.05，单侧），计算的t值（2.26）低于临界值表中值（4.96）。因此，方法的精密度，即重复性和中间精密度，都满足要求。
2.3.1.5 准确度
准确度评价范围在QL～0.8%的奈立膦酸钠量之间。向奈立膦酸钠活性物质溶液中加入已知量的亚磷酸盐得到各样品，通过本方法检测亚磷酸盐含量，记录回收率和RSD值。结果显示回收率在98.9%~104.1%之间，RSD值为2.0%，满足标准要求。
2.4 未知杂质
采用HPLC法检测奈立膦酸钠原料药中的未知杂质含量。
准确称量27.0mg奈立膦酸钠工作对照品，置于250mL量瓶中。加入约100mL HPLC用水，然后用同一溶剂稀释至刻度。取配成的溶液50mL，转移至100mL量瓶中，然后用0.2M枸橼酸钠溶液稀释至刻度。在Sovirel玻璃管中依次加入：5.0mL对照品溶液，5.0mL 0.1M硼酸钠（pH9.0），振摇，在加入5.0mL FMOC溶液（取250mg 9-芴甲基氯甲酸酯至250mL量瓶中，用乙腈溶解稀释至刻度），机械振摇约10秒，在室温下静置25分钟。加入25mL的二氯甲烷，振摇30～45秒，静置以便两相分离。取上层水相（必须澄清）作为对照品溶液。同法取27.0mg的奈立膦酸钠原料药配制供试品溶液。
2.4.1 色谱条件
色谱柱：Polymerx RP1（5μm，250×4.6mm）或等效柱；流动相为乙腈-甲醇-pH5缓冲液24：6：70（pH5.0缓冲液配制：取1000mL量瓶，将14.7g二水枸橼酸钠和7.05g无水磷酸氢二钠溶解在900mL HPLC用水中，磷酸调节至pH 5，然后加HPLC用水稀释至刻度）。流速1.0mL/min 等度洗脱，检测波长：265μm，柱温：35℃，进样体积: 50μL，奈立膦酸钠的保留时间约为9.5min。
2.4.2 方法学验证
2.4.2.1 专属性
分别取1%及0.1%奈立膦酸钠对照品溶液（0.0025mg/5mL和0.00025mg/5mL）、供试品溶液以及6-氨基己酸（起始物料）对照溶液（0.0025mg/5mL），色谱图见图5，在目标峰下无溶剂峰或起始物料峰的干扰，证明了其专属性合格。本实验同时还验证了该方法的破坏专属性，分别取在高温条件下（70℃）处理5天的样品以及室温下处理48h的样品进行检测，图谱分别见图6，奈立膦酸钠原料药在试验条件下相当稳定，活性成分峰始终纯净，未检测到含量超过最低检测限的降解产物。
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图5 高效液相色法测定奈立膦酸钠有关物质的专属性研究图谱
A-1%的奈立膦酸钠对照溶液 B-0.1%的奈立膦酸钠对照溶液
C-供试品溶液 D- 6-氨基己酸对照溶液
Fig 5. HPLC chromatograms of specifity in the study of detected Sodium Neonate related substances
A-1% Sodium Neonate Control Solution B- 0.1% Sodium Neonate Control Solution
C-Sample solution D- 6-aminohexanoic acid control solution
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图6 HPLC chromatograms of stressing test
A-High temperature condition B-Ambient temperature condition
2.4.2.2 定量限（LOQ）和检测限（LOD）
目标分析物的定量限和检测限通过特定校正曲线确定，校正曲线采用能达到的尽可能低的浓度（0.03%活性成分，即0.000075mg/5mL）。各溶液进样3次。结果评价根据线性回归线的斜率和截距的标准偏差进行。活性成分的LOD和LOQ计算值用未知杂质按相对奈立膦酸的面积百分比进行定量，LOD相当于3.3σ/S，LOQ相当于10σ/S。（σ为截距的标准偏差，S为线性回归的斜率）。计算得到的LOQ值为0.0005mg/5mL，LOD值为0.00025mg/5mL。
2.4.2.3 线性
线性评价范围为LOQ到样品溶液活性成分浓度（0.25mg/5mL）的1.3%。线性试验的溶液配制浓度0.00025、 0.0125、0.00250、0.00325mg/5mL。每份溶液进样3次。结果显示，目标分析物的测试方法在相关测试范围内呈线性，相关系数R2为1.000符合大于0.99的规定，说明该方法线性良好。
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图7.奈立膦酸钠含量标准曲线
Fig 7. Standard curve of Sodium Niledronate content
2.4.2.4 精密度
重复性试验中，由于奈立膦酸钠原料药不含任何未知杂质，所以精密度试验通过对6份独立的0.1%奈立膦酸钠原料药样品（相当于未知降解产物规定限度）测定含量进行每份样品进样一次，按测试方法测定。中间精密度是由不同的分析员，在不同时间内，使用不同的HPLC重复精密度试验。目标分析物的方法学试验中的精密度和中间精密度的两组数据无统计学差异，应用单因素ANOVA检验（p=0.005，单侧），计算的T值（2.50）低于临界值表T值（4.96）。证明了方法的精密度和中间精密度满足要求
2.4.2.5 准确度
准确度用从LOQ到样品溶液中活性成分浓度（0.25mg/5mL）的1.3%浓度范围的奈立膦酸评价。配制浓度为0.00025、0.0005、0.0025、0.00325mg/5mL的对照品溶液，每个浓度样品独立配制三份。根据外标校准模式，定量准确度样品，并表达为加入浓度和检测浓度之间的回收率。报告显示各个浓度下的回收率在97.4%~99.4%之间，符合所有溶液的准确度范围在90.0～110.0%的标准，且各浓度下的回收率RSD小于 10.0%。说明该方法的准确度满足规定。
2.4.2.6 耐用性
取2.4项下的对照品溶液以及供试品溶液，在初始色谱条件、流速0.2mL/min，色谱条件5℃以及流动相pH0.2pH单位的条件下进行检测。评价对照溶液进样的下列参数（方法质量指标）：保留时间（Tr），色谱效率（理论塔板数，欧洲药典）和峰对称性（对称性，欧洲药典）。从得到的结果（表4）中可以明显的看到，和预期一样，流速、柱温、缓冲液的pH或者流动相组分改变，影响目标分析物的保留时间，但不影响测定目标分析物方法的可信度，并且未检出未知杂质。考虑到对照溶液中目标分析物峰的系统适应性参数，该方法考虑对以下情况视为耐用：
·流速从0.8mL/min变化到1.2mL/min；
·流动相的缓冲液pH从4.8变化到5.2pH单位；
·柱温从30℃变化到40℃；
·流动相中缓冲液百分比从68%变化到72%。
表4：耐用性结果
Tab 4. Results of durability
条件 对照品溶液 样品溶液
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2.4.2.7 溶液稳定性
取2.4项下的对照溶液、供试品溶液以及0.1% 的供试品溶液分别置于透明容量瓶中，室温储存48h。没分溶液进样两次，在0、15、18、24h时对奈立膦酸钠的含量进行测定。结果显示样品溶液在18h后不再稳定。
3 结论
本实验建立了奈立膦酸钠原料药有关物质测定的方法学，利用简便快捷的薄层色谱法对原料药中的6-氨基己酸以及磷酸盐杂质进行监测，本实验中检测的78821,78819批的原料药中并未检测出这两种杂质。通过容量法对原料药的亚磷酸盐杂质检测的方法学验证说明该方法的专属性，线性，精密度，准确度都符合规定，可以应用于奈立膦酸钠有关物质的测定。最后，除6-氨基己酸、磷酸盐以及亚磷酸盐之外的其他杂质通过HPLC法进行，未有其他杂质检出。
综上所述，本文建立了完善的奈立膦酸钠有关物质的检测方法，为该药物的原料药监控以及制剂的研究提供了依据。
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