李枝玲1 居延娟2 李璐1
1江苏汉邦科技有限公司 江苏 淮安 223005
2江苏恒信诺金科技股份有限公司 江苏 淮安 223005
摘要:庆大霉素由于自身具备较强抗菌性，而被广泛应用，尤其是在革兰氏阴性菌引起的感染方面，治疗效果尤为明显。因此，文章重点对庆大霉素的分离纯化工艺进行了阐述，以供参考。
关键词:庆大霉素；发酵；纯化；工艺
1.庆大霉素的发酵
1.1高产菌株的筛选
从诱变育种的方面出发，研究人员筛选出了高产型庆大霉素菌株。通过紫外诱变方式处理了庆大霉素生产菌株JY1-12，然后通过摇瓶的方式筛选并分离出新型菌株JY3-5；通过摇瓶方式分离的诱变菌株JY3-5，使摇瓶效价增加了34.3％。储罐实验的发酵效价增加了18.6％。使用12C离子束辐射对庆大霉素高产菌株进行选育，生产发酵单位超过1300 u·mL-1。另外，还有一种广泛应用的新技术，即离子注入技术，它被应用在生物诱变方面；研究人员使用N +离子束注入技术对庆大霉素生产菌进行诱变，从而筛选出的诱变菌株产量有了明显提升，与出发菌株的产量相比，增加了27.39%。
在诱变育种过程中，通过选择的方式对相关或不相关抗生素进行筛选，可以快速获得突变株和高产菌株。选用的出发株为生产菌株绛红小单孢菌，采用N +离子注入和紫外线诱变技术，并使用浓度较高的庆大霉素梯度板完成筛选，筛选到摇瓶的效价均比出发菌株高，两种高产菌株N08和Wt63分别增长75.2％和70.1％，而10L发酵罐的发酵产量为2118u·m L-1和1843u·m L-1。
1.2培养基的优化
培养基是菌体生长和产物形成的载体，它可以为其提供所需营养和能量，在构建高效发酵过程前对其进行优化。研究人员对培养基中黄豆饼粉的含量进行了不同的试验，结果表明，当黄豆饼粉的含量为3.0％时，它对庆大霉素的发酵最为有用。
研究人员在实验中通过对培养基中葡萄糖与淀粉的比例进行改变，但两者的总含量依旧保持在6.5％不变，发酵120小时后以测定效价，结果表明，葡萄糖与淀粉之比在0.01时，可以大幅提升庆大霉素发酵的总效价。另外，通过脱去氨基酸中的氨基所形成的碳骨架进入TCA循环，可以使得TCA循环的代谢通量得到增加，达到增加细胞能量水平的目的，使得细胞生长和代谢产物更好进行合成，因此，在合成抗生素时，可以适量添加几种氨基酸，以使发酵水平得到提升。
1.3发酵工艺的改进
改善发酵工艺可以显著提升发酵水平，通过实验发现，氧气的供给会影响庆大霉素的发酵，如若氧气供应不及时，会导致发酵液中出现许多菌丝团，且还会降低发酵液的pH值，影响正常发酵。通过在庆大霉素发酵的尾声阶段，改变补水方式，将其改为补胨水(蛋白胨0.4%)，并将新型发酵液的生物效价与原工艺进行对比发现，其生物效价提高了3.23％。
1.4庆大霉素胞外分泌的研究
一直以来，在提高庆大霉素产量方面，研究重点主要在选育高产菌株和改良发酵技术上，虽然有所成就，但效果没有达到预期。因此，一些研究人员将这方面的研究转向庆大霉素分泌机理上。结果表明，菌体分泌所得的庆大霉素部分紧密与菌丝体结合。在对庆大霉素与菌丝体研究发现，二者之间是非特异性结合，通过使用超声波有助于菌丝体释放出庆大霉素，但无法达到完全释放；通过对庆大霉素在菌体中的存在方式进行分析研究发现，胞内庆大霉素主要吸附在菌丝体细胞壁上，从而出现胞内庆大霉素浓度比胞外浓度大的现象；研究人员通过对棘孢小单胞菌绛红变种细胞壁肽聚糖进行研究发现，其可以吸附庆大霉素，且已肽聚糖吸附的庆大霉素比例约占细胞壁吸附总量的95％，在发酵时通过添加适量Mg2 +，Na +等金属离子，可以对其进行解吸。
此外，通过将一些能增加细胞膜通透性的物质添加至培养基中发现，可以提高庆大霉素的分泌率；同时还通过分析推断发现，通过增加细胞膜的通透性，也可以使膜内的庆大霉素透过膜与细胞膜更好的结合，当细胞壁结合的庆大霉素浓度达到一定程度，便会开始向胞外分泌。事实证明，膜的通透性会对庆大霉素的分泌造成严重影响；通过对微波处理庆大霉素分泌的影响进行研究发现，经微波127.5 W和40s多次处理后，分泌率可达47.5％，总效价增加48.05％。
研究表明，庆大霉素是通过在膜中合成，然后向膜外分泌并吸附在细胞壁上，因此，可以看出增加庆大霉素的细胞外分泌率可以提高庆大霉素的产量。因此，在实际中可以从两个方面着手：增加细胞膜的通透性或者使用在线机械振动对庆大霉素进行分离。
2.庆大霉素的提纯
2.1离子交换法
在提取庆大霉素发酵液时，最常用的方法是离子交换法。一般，将离子交换树脂作为离子交换材料，而离子交换纤维是一种新型离子交换材料，离子交换纤维比离子交换树脂的交换面积更大、速度更快。通过对羧酸根离子交换纤维对庆大霉素的吸附性能进行研究，发现pH为8时，庆大霉素的静态交换容量高达3.22 x 104 u·g-1；发酵液中庆大霉素动态交换容量和洗脱率分别为2.01×104u·g-1和92.7％。
2.2泡沫分离法
泡沫分离法是通过表面活性剂的界面作用对浓缩溶质进行分离，并对液相体进行纯化的技术，多用于分离纯化环境废水中的重金属、生物蛋白、酶和微生物。当前，泡沫分离方法逐步被广泛用于分离纯化抗生素。
通过研究使用相当于发酵液的庆大霉素制备溶液、实际发酵液分离方法，发现使用十二烷基硫酸钠和烷基醇聚氧乙烯的混合表面活性剂对庆大霉素进行处理，收率可以最大化，因此使用十二烷基硫酸钠作为捕集剂；此外，通过泡沫分离法分离所得的制备溶液中，实际分离发酵液中庆大霉素收率是60％，庆大霉素收率高达72％；研究人员利用泡沫分离法提取庆大霉素时，使用生物表面活性剂牛血清白蛋白代替十二烷基硫酸钠，发现牛血清白蛋白的浓度会影响庆大霉素的提取率，当牛血清白蛋白浓度超过200μg? m-1时，庆大霉素的收率将增加至80.2％，这是由于牛血清白蛋白难以与庆大霉素形成络合物并沉淀，且在无机盐的作用下，可以对牛血清白蛋白的表面张力进行改变，以使鼓泡性能得到改善，并显著提高收率。
2.3反胶束萃取法
对生物产物进行分离的反胶束萃取技术已经受到越来越多的关注，并且在蛋白质和氨基酸的提取方面进行了多项研究。反胶束是在非极性有机溶剂中添加表面活性剂，当反胶束浓度比临界胶束浓度（CMC）大时，会形成一种纳米级聚集体（亲水极性头朝内、疏水长链尾朝外），它的极性核可溶解少量水以形成一种微水池。当含有该反胶束的有机溶剂与生物活性物质的水溶液发生接触时，生理活性物质会溶解在该“池”中，此技术被称为反胶束萃取技术。
2.4沉淀法
由于某些表面活性剂在特定浓度范围内，会在反离子的作用下沉淀，所以也可以使用表面活性剂作为沉淀剂，在水相中沉淀，并对某些反离子进行分离，此方法被称为沉淀法。
使用沉淀法分离提取庆大霉素，发现当NaCl≥0.05 mol·L-1且沉淀剂与庆大霉素比率为4时，庆大霉素会100％沉淀，且沉淀物可以重新溶解在碱性溶液中，重新溶解的牛血清白蛋白可以用丁醇提取和回收。该沉淀法具备高收率、高抗干扰能力、操作便捷的优点，实用价值极高，但此方法的缺陷是提取分离的产物纯度较低，需加大研究力度。
2.5膜分离法
在过去的几十年中，膜分离技术得到快速发展，它是一种新型分离、浓缩，纯化技术，具备节能、污染小、操作方便、对产品结构不破坏的优点，被广泛用于提取抗生素。纯化抗生素的膜分离技术较多，如超滤、液膜分离、纳滤、反渗透等。通过对纳米滤膜技术进行使用，以浓缩庆大霉素B，并基于小型试验构建了浓缩庆大霉素B的纳滤系统。
结束语
随着科学技术的不断发展，抗生素的研究也取得了较大突破，在治疗疾病方面发挥着至关重要的作用。在抗生素中，庆大霉素属于一种广谱抗生素，且具备较好的抗菌效果，在临床中被广泛使用，因此，应不断加大其分离纯化研究力度，从而提高分离纯化庆大霉素的效率。
参考文献：
[1]宋汉民，刘颖，王丽萍等硫酸庆大霉素原料及配方中杂质的分析[J],中国抗生素杂志，2018，39（7）：513-519
[2]杨立宏，李进，傅昌清,微量成分中庆大霉素杂质的HPLC-ELSD分析[J],药物分析杂志，2018，34（1）：75-84
[3]刘颖，王丽萍,庆大霉素质量标准变化对庆大霉素质量的影响[J],药物分析杂志，2017，97（2）：207-214