（浙江大学附属第一医院乳腺外科 浙江杭州 310000）
【摘 要】探讨长链非编码 RNA LINC011614在三阴性乳腺癌中的表达水平作用。方法：采用实时定量PCR方法，检测不同乳腺癌细胞株与正常乳腺上皮细胞系，乳腺癌组织与癌旁组织中的表达量。构建敲低的稳转细胞株，采用CCK8、流式细胞检测术、细胞克隆及划痕等功能实验检测LINC01614与增殖和迁移能力的变化。结果：LINC01614 在TNBC细胞和乳腺癌组织中均明显高于正常细胞及癌旁组织；敲低LINC01614后细胞增殖及迁移能力减弱，细胞周期阻滞。结论：LINC01614在乳腺癌中高表达且参与了肿瘤的发生发展,机制可能与其过表达可促进乳腺癌细胞增殖,并促进转移有关，可作为乳腺癌预后预测和治疗的潜在靶点。
【关键词】三阴性乳腺癌；长链非编码RNA；LINC01614
【中图分类号】R159 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2019）08-0251-02
乳腺癌具有高度异质性，是全球女性第二大癌症相关死因。我国近10余年发病率逐年攀升，在一些大中型城市，乳腺癌已然成为严重危害女性健康的最常见恶性肿瘤[1]。目前对乳腺癌的主要治疗手段为手术治疗结合术后放化疗及内分泌治疗的综合治疗，尤其是蒽环类和紫杉醇等抗癌药为主的化疗方案的逐步应用，乳腺癌病人术后的生存率明显较大提高。然而长期的联合化疗会使乳腺癌细胞对化疗药物产生耐药性，进展期乳腺癌患者常常因肿瘤对化疗药物的多药耐药，导致化疗失败，肿瘤复发转移，严重影响生活质量和长期生存率。恶性骨肿瘤多发并难以治愈， 超过一半的晚期前列腺癌和乳腺癌患者会出现骨转移[2-3]。因此，寻求其他有效的治疗手段，已成为目前乳腺癌治疗研究的热点。
乳腺癌是一个多因素、多基因参与、多阶段形成的复杂的异质性疾病，病程中伴随着有害突变的积累、基因组不稳定性的增加、表观遗传学修饰的改变以及众多癌基因和抑癌基因的功能和表达异常的分子事件。长链非编码RNA（Long noncoding RNA , LncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的RNA[4],本身并不编码蛋白质，而是以RNA的形式在表观遗传学、转录、转录后调控等多种层面上影响基因的表达,与基因沉默、转录激活、染色体构型修饰等密切相关，其表达异常亦可影响肿瘤的发生、发展、侵袭、转移及预后[5]。目前有研究表明某些LncRNA仅会编码几个至十几个氨基酸的Microprotein,并与特定疾病关系密切[6]。研究表明，HOTAIR（HOX transcript antisense RNA , HOTAIR）与乳腺癌的预后，细胞干性和临床病理特征相关[7-8]。而LncRNA LSINCT5则能够在乳腺癌和卵巢癌中高表达并且调控肿瘤细胞的增殖，影响肿瘤的侵袭[9]。LncRNA在乳腺癌发生、发展中发挥作用的机制初现端倪，但仍有待深入探究。
LINC01614在肺癌中高表达，而敲除LINC01614后可以通过上调mir-217和下调foxp1抑制肺腺癌细胞的进展[10-11]。LINC01614在乳腺癌组织中显著高表达 [12]。有研究报道LINC01614通过TGFβ和FAK信号通路参与乳腺癌不良预后的调控，一般情况而言不良预后往往伴随着肿瘤的复发与转移[12]。三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）由于肿瘤分化程度低、异质性高、侵袭及转移脏。
故本研究围绕LINC01614与三阴性乳腺癌的增殖及转移展开研究。
1 实验材料及方法：
1.1 收集本院 2018年 1 月至 2018 年 6月女性乳腺癌患者手术切除的 10对癌组织和癌旁组织，均经病理组织学证实为三阴性乳腺癌，术前均未行抗肿瘤治疗，手术切除的组织立即冷冻于-80 ℃以用于提取 RNA。
1.2 细胞及试剂：正常人乳腺细胞系MCF10A和人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468购于美国模式培养物保藏所细胞库。培养基和胎牛血清购于美国 BI公司。 RNeasy Mini Kit、逆转录试剂盒QuantiTect Reverse Transcription Kit 和 QPCR 试剂盒QuantiTect SYBR Green PCR Kit 购自日本takara公司，LINC01614和内参 GAPDH 引物由杭州有康生物公司合成。CCK8及流式周期试剂盒均购于江苏碧云天生物公司。LINC01614干扰的慢病毒及对照由上海吉凯基因公司提供。
1.3 实验方法：
1.3.1 细胞培养：乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7）及正常乳腺细胞系MCF10A使用10%胎牛血清和高糖DMEM培养基，均在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。
1.3.2 CCK8法检测：将细胞打成悬液，密度为2×104个/ml的单细胞悬液。按照每孔100μl的体积接种到96 孔培养板内，每组设置6个复孔，同时设置空白组（只加培养基）。将培养板置入培养箱中继续培养，分别在培养24h、48h、72h、96h和120h时将原培养基更换含为100μl含10%CCK-8溶液的无血清培养基。将培养板置入培养箱中孵育1h后，测定450nm 波长下各孔的光密度（OD）值。所测各组OD值减去空白组OD值的平均值即为各组的实际OD值，以24h的OD值为基准值，计算不同时间点各组细胞的增殖速率（实际OD值/基准值×100％）。
1.3.3克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力:将细胞打成悬液，按250个/ml的密度接种含6孔板中，每孔2ml。将培养板置入细胞培养箱中培养2-3周，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，用4%多聚甲醛固定细胞后洗去染色液，将6孔板倒置于空气中干燥。用相机拍摄每孔克隆形成情况，并用肉眼直接计数克隆，或在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。
1.3.4 PI单染流式细胞术检测细胞周期：将细胞悬液转入15ml离心管中，收集并调整细胞浓度为1×106个/ml，取1ml单细胞悬液。加入100%冷乙醇4ml固定，4℃保存过夜。将 Rnase A:PI 工作液按 1:9 体积配制成PI/RNase A染色工作液。染色前用 PBS 洗去固定液，2000rpm离心5min。加入500μl染色液，室温避光孵育30-60min后上机检测。
1.3.5划痕实验检测细胞迁移能力：将细胞接种在6孔板中，待细胞融合度达100%时，使用移液器头垂直划出3个间隔，置于含不同干预因素的无血清培养基中培养。于0、24和48 h分别拍照，比较划痕宽度。
1.3.6 RT-qPCR 检测LINC01614 表达组织或细胞经 Trizol法提取总 RNA，反转录获得 cDNA，使用 ABI-7500PCR 仪进行扩增和检测，并分析计算其表达量。引物序列：LINC01614 F: 5′-AACCAAGAGCGAAGCCAAGA-3; R:5′-GCTTGGACACAGACCCTAGC-3′; GAPDH F: 5′-CTGGTAAAGTGGATATTGTTGCCAT-3′; R: 5′-TGGAATCATATTGGAACATGTAAACC-3′。
1.4 统计学分析
使用SPSS 22.0 软件统计分析数据，使用Graphpad Prism 7 软件制作图像。所有数据均为至少3 次独立重复实验的平均结果。计量数据用平均值±标准差来表示。当两组独立样本满足正态分布及方差齐性时，采用t检验，否则采用校正t检验或非参数检验。多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 时认为具有统计学意义。
2 结果：
2.1 LINC01614 在TNBC细胞和组织中均高表达
首先在乳腺癌细胞系中检测LINC01614的表达水平，发现LINC01614在TNBC细胞系的表达水平远远高于MCF10A（图1A）；接着检测TNBC组织中LINC01614的表达水平，LINC01614在TNBC组织的表达水平高于癌旁组织（图1B）。初步说明LINC01614在乳腺癌恶性肿瘤TNBC中是高表达的，可能与TNBC的增殖与转移相关。
图1. LINC01614在TNBC细胞系和TNBC组织中高表达
A.乳腺癌细胞系中LINC01614的表达水平；B.TNBC组织和癌旁的表达水平。
2.2 LINC01614敲低影响TNBC细胞系MDA-MB-231的增殖和凋亡；
敲低LINC01614后MDA-MB-231细胞的增殖能力变弱，并出现细胞周期阻滞情况，G1期细胞比例增加同时伴随着细胞凋亡变多（图2B-D）;克隆形成实验进一步验证MDA-MB-231敲低后细胞增殖能力减弱（图E）
图2 MDA-MB-231敲低LINC01614导致细胞增殖能力减弱和细胞凋亡增加
A. LINC01614的敲低情况； B.CCK8实验检测细胞增殖;C.细胞周期检测；D细胞凋亡检测；E克隆形成实验。
2.3 LINC01614敲低影响TNBC细胞系MDA-MB-231迁移
划痕实验检测敲低LINC01614是否影响细胞的迁移，发现敲低LINC01614后细胞迁移能力减弱(图3)
图3 细胞划痕实验
3 讨论：
乳腺癌是女性发病率最高的癌症，而三阴性乳腺癌 (TNBC) 是乳腺癌中恶性程度最高的一个亚型，且治疗方式极其有限。与其它亚型相比，TNBC患者容易复发及转移，预后较差。因此，为改善TNBC患者的预后，亟需进一步探索TNBC可能的分子病理学机制，以寻找新的诊断标志物以及治疗靶点[13-14]。LncRNA近年来被发现在肿瘤发生发展中起到重要作用，其可通过表观遗传修饰、转录和转录后调控基因表达等多种方式参与调控肿瘤细胞增殖、侵袭迁移以及肿瘤血管生成等生物学行为[15-16]。
LINC01614在肺癌中高表达，而敲除LINC01614后可以通过上调mir-217和下调foxp1抑制肺腺癌细胞的进展[10-11]。LINC01614通过TGFβ和FAK信号通路参与乳腺癌不良预后的调控。三阴性乳腺癌侵袭及转移脏器能力强、复发率高，且缺乏有效的治疗手段，预后极差，是乳腺癌临床治疗的重大难题。然而，LINC01614在三阴性乳腺癌中的表达及转移相关性未曾有报道。
本研究检测了三阴性乳腺癌组织及细胞系中LINC01614的表达水平，以进一步证实LINC01614在三阴性乳腺癌中的表达是否上调。与其他类型肿瘤中的报道一致，乳腺癌组织的LINC01614水平较正常组织升高。该结果有力地提示了 LINC01614 作为检测三阴性乳腺癌潜在生物标记物的可能性。
在细胞功能实验中，敲低LINC01614的表达后，细胞增殖能力显著降低，细胞周期阻滞于G1期，并且凋亡数量增加。划痕实验进一步证明了细胞的转移能力下降。以上结果支持 LINC01614参与了三阴性乳腺癌的发生发展，可能是三阴性乳腺癌的潜在治疗靶点。
综上所述，LINC01614在三阴性乳腺癌中高表达且参与了该肿瘤发生发展，可作为乳腺癌预后预测和治疗的潜在靶点。本研究样本量较少且未评估该指标的不良预后风险，后续将扩大样本量进行完善。LINC01614通过何种途径或信号通路来调控三阴性乳腺癌的发生发展目前尚不清楚，这将为今后的工作重点，后续将借助体外细胞实验来验证。
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基金资助：
2017浙江省教育厅课题（Y201738263）