孙国栋1 、李蓉香2
1长治医学院 046000
2长治医学院附属和平医院 046000
【摘要】目的：探究TBX18腺病毒是否能够成功转染骨髓间充质干细胞，并使其向心肌细胞分化。方法：取成年SD大鼠的四肢骨髓将其分离培养为骨髓间充质干细胞，构建重组腺病毒-绿色荧光蛋白Ad-TBX18载体，转染后的骨髓间充质干细胞设为试验组，并将只是转染绿色荧光蛋白的空载病毒组和空白对照组进行比较。应用免疫组化技术检测诱导后三组细胞肌钙蛋白I（cTnI）、α-横纹肌肌动蛋白（α-SCA-actin）阳性表达情况，并应用Western blot法检测cTnI、α-SCA蛋白表达水平。结果：骨髓间充质干细胞的转染效率高达95%。试验组的cTnI、α-SCA阳性表达率以及其蛋白表达水平均显著高于空载病毒组、空白对照组（P<0.05）。结论： TBX18腺病毒可成功转染骨髓间充质干细胞，在细胞内稳定表达，且能够诱导其向心肌细胞分化。
【关键词】骨髓间充质干细胞；心肌细胞；TBX18腺病毒
【 Abstract 】 Objective: To investigate whether TBX18 adenovirus can successfully transfect bone marrow mesenchymal stem cells and make them differentiate into cardiomyocytes.Methods: Bone marrow cavities of the limbs of adult SD rats were isolated and cultured into bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) to construct recombinant adenovirus-green fluorescent protein Ad-TBX18 vector. The transfected BMSCs were set as experimental group, and the empty virus group transfected with green fluorescent protein only was compared with the blank control group.Immunohistochemistry was used to detect the positive expression of troponin I (cTnI) and α-Sca-actin in three groups after induction, and Western blot was used to detect the protein expression levels of cTnI and α-Sca-actin in three groups after induction.Results: The transfection efficiency of BMSCs was up to 95%.?The positive expression rates of cTnI and α-SCA and their protein expression levels in experimental groups were significantly higher than those in no-load virus group and blank control group (P<?0.05).Conclusion: TBX18 adenovirus can be successfully transfected into bone marrow mesenchymal stem cells, stably expressed in the cells, and can induce differentiation into cardiomyocytes.?
【 Key words 】 Bone marrow mesenchymal stem cells;?Myocardial cells;?TBX18 adenovirus
骨髓[格式]间充质干细胞为一种多能干细胞，其具有自我更新、多向分化潜能，能够分化为神经细胞、成骨细胞、脂肪细胞，相关研究报道其还能够在一定条件下跨谱系向心肌样细胞分化[1]，也有动物实验发现[2]，在心肌梗死大鼠的心脏缺血区域注射骨髓间充质干细胞可改善心脏功能，但其可引起心律失常等严重并发症，故临床在使用骨髓间充质干细胞前需进行必要的处理。大量研究表明[3]，T-BOX基因在胚胎心脏发育中发挥着积极的作用，而且有文献指出[4]，TBX18腺病毒载体能够在体外诱导乳鼠心肌细胞向起搏样细胞分化，但其是否能够诱导骨髓间充干细胞向心肌细胞分化尚无明确的说法。本研究将TBX18腺病毒应用于骨髓间充干细胞诱导中，使其转化为心肌样细胞，为今后临床研究提供实验参考。
1材料和方法
1.1实验动物和试剂
15只健康成年SD大鼠（雌7只，雄8只），每只大鼠体重150-200g；质粒载体pHBAd-MCMV-GFP、腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP-TBX18（上海汉恒生物科技有限公司）；鼠抗 cTnI单克隆抗体（上海抚生实业有限公司）；兔抗α横纹肌肌动蛋白单克隆抗体（上海抚生实业有限公司）；免疫细胞化学染色试剂盒（上海爱必信生物科技有限公司）。
1.2实验方法
1.2.1骨髓间充质干细胞分离培养[通过提取原代获取骨髓间充质干细胞首先应该补充骨髓间充质干细胞的鉴定，比如细胞形貌图、流式检测表面标志物的表达和多向分化潜能鉴定，以明确你提取的细胞是骨髓间充质干细胞。另外。提取第一代的骨髓间充质干细胞通常需要纯化才可以用于细胞实验，所以用第二代的细胞去做实验需要明确骨髓间充质干细胞纯度，补充纯化过程]：应用颈椎脱臼法将实验大鼠处死，然后将大鼠浸泡到75%酒精中，时间5分钟，于无菌环境下取大鼠的股骨和胫骨，应用浓度100mg/L青霉素、链霉素混合液中对长骨冲洗2次。随后充分暴露骨髓腔，用含有胎牛血清的伊思柯夫改良培养液将骨髓腔内骨髓冲出，且使用无菌滤膜将骨髓转移到培养瓶内，在5%二氧化碳、37℃环境中培养，首次换液为24h后，随后为每隔3天换液1次，若细胞融合达到90%时，使用0.25%胰酶（0.04%EDTA）混合液对其消化传代，传至第2-3代时将其应用于后续实验。每日应用显微镜察看骨髓间充质干细胞贴壁、形态以及生长状况。
1.2.3骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定：取第3代汇合到80%-90%的骨髓间充质干细胞，去掉原来的培养基，用PBS缓冲液漂洗1次，并对其反复吹打，将细胞悬液移到15ml的离心管中，常规进行离心处理，弃掉上清液，重悬细胞将细胞浓度调节到1×1010/L，然后将其分装到9支5ml离心管中，每支200μL，分别加入大鼠抗CD29-PE、CD90-PE-Cy7TM抗体、CD45-FITC及其同型的对照抗体，阴性对照组添加适量PBS缓冲液，混匀后静置30分钟，常温下进行离心处理，弃掉上清液，反复2次，再加入500μLPBS缓冲液，制成单细胞悬液，应用流式细胞仪鉴定。结果显示，CD29、CD90、CD45抗体阳性表达率依次为99.14%、97.08%、1.52%，即培养的骨髓间充质干细胞以CD29、CD90标志物为主，几乎不表达造血干细胞CD45，提示该方法培养的骨髓间充质干细胞较纯净。
1.2.3实验分组：（1）先根据最适感染复数（MOI）值0、5、10、15、20、25、30、40、50依次加入带有TBX18、GFP腺病毒培养24小时、48小时后应用荧光显微镜观察，以不导致明显细胞病变效应的最大MOI值作为最适MOI，此次研究中最适MOI为20。（2）第2代细胞培养48小时后于细胞培养板加入腺病毒骨架载体pHBAd-MCMV-GFP-TBX18构建[载体是质粒载体]重组腺病毒质粒-绿色荧光蛋白Ad-TBX18载体，并将此转染后的骨髓间充质干细胞设为试验组；另取第2代细胞加入pHBAd-MCMV-GFP重组腺病毒质粒载体，设为空载病毒组；不加入任何诱导剂的第2代细胞设为空白对照组。各组转染24小时、48小时后用荧光显微镜观察细胞形态。
1.2.4免疫组化检测：根据《免疫组化技术》要求，取诱导7天后的细胞制片，用4%多聚甲醛固定，加入cTnI一抗、α-SCA-actin一抗孵育24小时后进行显色复染并在荧光显微镜下阅片，若细胞质出现棕黄色颗粒判断为阳性细胞。每一组均选择8个载玻片进行检测，而且每个载玻片随机选择5个视野（不重叠）观察，每个载玻片计算阳性细胞着色百分比。
1.2.5 Westernblot法检测cTnI、α-SCA-actin蛋白表达水平[目前用WB检测最少需要三次生物学重复，2次技术重复，作者没有体现，而且结果显示所用内参为β-actin，而不是GAPDH，另外每做一次目标蛋白检测都应该附带跑一次内参，作者的结果很明显条带不是用的同一次实验的条带，最后实验过程应该再细化一些，过程太简略。]：①收集诱导实验7天后的细胞，在常温离心弃掉上清液，吸干水分，每5×106个细胞添加500μLRIPA裂解液，在4℃条件下依次进行振荡、离心处理，然后快速将其上清液吸取到另一预冷的离心管中，测定每个蛋白样品的蛋白浓度。②每个蛋白样品加入5倍量的蛋白上样缓冲液，加热10min以使蛋白变性，静置冷却到室温后，将蛋白样品添加到SDS-聚丙烯酰氨凝胶上样孔内进行电泳，见有溴酚蓝跑出停止电泳。③应用美国Bio-rad Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统完成转膜。④加入相应的一抗稀释液（cTnI、α-SCA以1:1000的比例稀释，β-actin以1:10000的比例稀释）在4℃条件下孵育过夜，用TBST溶液冲洗3次。再加入二抗稀释液在室温下孵育120分钟，再用TBST溶液冲洗3次。根据实际的光强度合理调节曝光条件，扫描胶片并应用AlphaEaseFC软件处理系统对目标带的光密度值进行分析，以β-actin蛋白作为内参[内参为GAPDH，结果为actin自相矛盾。]进行相对定量分析，计算cTnI、α-SCA-actin蛋白相对表达量，至少重复3次。。
1.3观察指标
①观察试验组、空载病毒组细胞诱导分化过程中细胞形态变化情况。②比较三组细胞cTnI、α-SCA-actin阳性表达情况。③比较三组细胞cTnI、α-SCA-actin蛋白相对表达水平。
1.4统计学方法
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3讨论
当前临床中，采用介入、药物手段治疗心血管疾病仍不能在根本上修复心肌细胞的功能，故如何有效修复坏死心肌细胞，提升心肌细胞的利用率为临床试验研究的热门。有研究报道[5]，通过移植干细胞能够修复坏死的心肌细胞，改善心功能。干细胞自身有多向分化的能力，因此在应用干细胞移植前需将其进行定向分化以进一步提高治疗效果，保证治疗安全。鉴于此，越来越多体外研究发现[6]，合理应用诱导剂能够促使骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。
TBX18为T-BOX转录因子家族的一员，其也是心脏祖细胞形成[什么祖细胞]的一种标志因子。目前研究中有多项文献报道了在动物心脏发育过程中在心室壁、心房壁、室间隔的间充质祖细胞、心肌细胞中均有阳性表达，为胚胎期心脏发育的主要转录因子[7]。与此同时，利用TBX18进行诱导培养时其在细胞中的表达稳定与选择何种病毒载体密切相关。其中，腺病毒为当前国内外研究中最常用的一种病毒载体，对分裂期、非分裂期的细胞均有高效的转导作用[8]。本研究构建TBX18腺病毒载体转染诱导骨髓间充质干细胞，结果显示培养的骨髓间充质干细胞以CD29、CD90标志物为主。而且试验组、空载病毒组细胞转染后在倒置荧光显微镜中呈绿色荧光，48小时后存活的心肌细胞贴壁，且细胞搏动稳定，绿色荧光增强，提示该方法培养的骨髓间充质干细胞较纯净。
此外，本研究结果还显示，试验组cTnI、α-SCA-actin阳性表达率及cTnI、α-SCA-actin蛋白表达水平均显著高于空载病毒组、对照组（P<0.05）。肌钙蛋白I（cTnI）为具有高敏感度、高特异性的反映心肌细胞损伤程度的客观指标，大多分布在心肌细胞、骨骼肌细胞，而其与平滑肌细胞无交叉反应，能够敏感地检测到心肌小病灶的可逆性损伤[9]。α-SMA也是临床常用的鉴别心肌细胞功能的指标，其能够诱导分化具有心脏肌小节的心肌细胞[10]，因此从本研究来看利用TBX18腺病毒诱导骨髓间充质干细胞能够使其向心肌细胞分化。但是当前研究仍处于细胞水平试验阶段，还需在大动物模型中进行研究和验证才可以指导临床应用。
参考文献
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