摘要：随着我国经济的快速发展和社会的不断变化，我国的科学技术也取得了巨大的进步，为各领域的科学研究提供了强大的技术支持。荧光定量PCR技术是在原有的PCR技术基础上发展起来的一种新兴核酸定量技术，是时代发展的产物，他可以进一步将荧光能量传递技术应用于常规的PCR仪器中，在整个反应体系中增加荧光染料或者是荧光基团，主要是利用荧光信号的积累来实现对整个PCR过程的实时监测，并最终根据反应标准曲线对未知模板浓度进行预测。如今，荧光定量PCR技术已经被应用于国内外的环境监测方面，有利于加强对环境中微生物的检测和研究工作，随着该项技术的不断完善和发展，未来在环境微生物检测方面将会有着广阔的发展及应用前景。
关键词：荧光定量；PCR技术；环境微生物；检测；应用研究
一、荧光定量PCR技术原理及特点
（一）基本原理
荧光定量PCR技术对整个PCR反应过程进行实时的监测，并可以对收集的荧光信号进行连续的分析，随着反应时间的不断增加，监测到的荧光信号变化可以绘制成一条连续的曲线，有利于对环境中的微生物进行检测。在PCR反应的早期，反应过程中的荧光水平与背景之间没有明确的区别，导致荧光的产生处于指数期、线性期及最终的平台期。荧光定量PCR技术的基本原理首先需要设置一个定量的荧光信号域值，通常这个荧光信号域值是作为PCR反应前15个循环的荧光本底信号，并保证这15个循环内的荧光信号是标准偏差值的10倍左右。在PCR过程中如果检测到荧光信号超过设置的域值，那么这个就是真实的荧光信号，可以用来对域值循环数进行定义。域值循环数（Ct）的含义是每个反应管内的荧光信号达到设置的域值时所经历的循环数，Ct值与模板量之间存在线性关系，随着模板量的增加，Ct值会有所降低。因此，在荧光定量PCR技术应用过程中，如果可以得到检测样品的Ct值，则可以根据标准曲线的变化对该检测样品的起始拷贝数进行分析并确定。
（二）特点
通常情况下PCR产物都需要经过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或者是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，在反应过程中需要用到多种仪器设备，且需要耗费大量的时间和劳动力，反应的原材料会对人体产生危害，并在实验中产生假阳性的污染，虽然荧光定量PCR技术在实践操作上存在很多的缺点，但是它还是有很多的优点的，这些显著的优点让它得以在环境微生物检测中的加以应用。
首先是特异性能好，在使用针对靶序列设计的特异性探针对定量分子进行识别的过程中具有很高的准确性，可以快速、高效的完成任务，而且可以加强对靶序列设计及特异性探针的双重控制，增加其特异性能，一定程度上降低假阳性。其次是灵敏度较高，荧光定量PCR技术是一项综合了PCR技术、荧光标记技术、数码显像技术以及激光技术为一体的新型技术，取其精华、弃其糟粕，有效的提高了技术的检测灵敏度。然后是荧光定量PCR技术的线性关系好，在线性范围宽度上具有较大的优势，在环境微生物检测过程中，荧光定量PCR技术由于荧光信号的产生可以和每次扩增的产物形成一一对应的关系，这样就为产物的定量提供了极大的便利。最后是速度快、效率高，荧光定量PCR技术是多项技术精华的综合，通过在实践中的应用发展，已经可以实现在短时间内完成多个样品的定量分析，这大大减少了工作人员的劳动量，提高了工作效率和工作质量。
二、实时荧光定量PCR在环境微生物领域中的应用
（一）用于检测环境中的致病微生物
环境中存在着多种多样的致病微生物,它们与许多传染性疾病的传播和流行密切相关。因此,定期检测环境中致病微生物的动态(种类、数量、变化趋势等)具有重要的实际意义。传统检测方法是对病原体进行人工培养或细胞培养,或是对无法培养的病原体进行显微镜检测,这些方法不仅耗费大量的人力、物力和财力,而且准确度差。采用荧光定量PCR技术检测环境中的微生物病原体,无需培养而是直接取样进行分析。特异性强、灵敏度高、迅速简便且具有较高的精确度。Brooks]等对雨季时海水中的甲肝病毒,采用该技术进行了检测及定量分析。研究证明,该技术对甲肝病毒的定性及定量测定均有很高的精确度。同时指出了PCR技术对于环境微生物定量测定的发展前景。Rebecca等采用FQ-PCR对容易引起水传播疾病的贾第虫和隐孢子虫进行了定量检测分析,建立了定量分析方法。
（二）用于环境微生物群落结构与群落动态的研究
对于环境微生物的研究主要是依赖于纯培养,由于环境微生物中只有一部分能被培养。因此,进行微生物群落分析时其结果往往是局限的。基于rRNA的分析技术改变了微生物种群结构分布描述困难的现状。采用实时荧光定量PCR技术可定量检测目标溶藻菌如铜绿假单胞菌、交替假单胞菌等的含量与分布。Skovhu等运用交替假单胞菌属的特异性引物,快速检测出目标细菌DNA模板在总DNA模板中的比例,进而推算出目标细菌在环境样本中的丰度。赵传鹏等应用实时荧光定量PCR法,对除藻反应器中各种填料介质对太湖水中溶藻细菌之一的假单胞菌属的富集情况进行评价显示,所建立的方法能有效检测反应器中填料对该类溶藻细菌的富集程度,初步证明所建立的方法可有效定量假单胞菌属在环境样本中的丰度。应用FQ-PCR技术不仅能研究微生物群落结构与分布的特征,还可以跟踪微生物种群的动态变化。Okano等通过对氨单加氧酶基因(amoA)进行定量检测来确定土壤中氨氧化细菌(AOB)群落大小,同时研究了铵离子浓度对氨氧化细菌群落的影响。发现随着铵离子浓度增加,氨氧化细菌数量也呈不同程度增长,而细菌总数稳定在一定的范围。同时还发现常年施肥的土壤中氨氧化细菌显著增长,说明铵肥对氨氧化细菌群落具有长期影响。
三、荧光定量PCR技术应用存在的问题
实时荧光定量PCR技术在检测的过程中会受到如寡核苷酸杂交特异性、Taqman探针比例、SYBR浓度大小、PCR产物尺寸的长短等因素影响,可能造成定量结果出现偏差或导致假阳性结果。因此,在操作时必须对所设计引物的特异性进行充分验证和条件最优化研究。实时荧光定量PCR标准曲线的定量方法也存在一些问题有待解决。在标准曲线定量中,标准品的制备是一个必不可少的过程。但目前由于无统一标准,各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同,致使实验结果缺乏可比性。同时,标准曲线的制作可能存在一定的偏差。例如在定量一些不可培养微生物时,可能要用质粒DNA的拷贝数来换算才能得到某一微生物种类的丰度,其准确性则值得探讨。由于实时荧光定量PCR技术需要特殊的热循环仪和试剂,其检测成本比较高,从而也限制了其广泛的应用。荧光定量PCR所采用的是特异性DNA的体外扩增,由于DNA的检测无须使用活细胞,从理论上讲任何可以提供核酸物质的样品都可以进行PCR扩增,则以往由于处于休眠状态而无法培养的细菌同样可以被检测到,这说明荧光定量PCR技术不能区分活细胞和死细胞,可能会造成虽然扩增反应特异性较高但定量不准确的结果。同时,在检测环境中的致病菌与指示菌过程中,对所检测到的病原体是否具有感染力也无法做出准确判断,这是一个待解决的问题。在许多生态系统中微生物的丰度较低和细胞中rDNA含量较少都会限制其检测的敏感度。同时对一些环境样品微生物定量时,也会受到非靶序列DNA的干扰。如何排除背景的影响,使实时荧光定量PCR具有普遍性是人们面临的又一个挑战。
三、加强应用的有效措施
第一，要加大对荧光定量PCR技术应用的人力、物力和资金的投入力度，重视荧光定量PCR技术的应用，将其落实到实处，认真做好每一项工作。还可以设立虚拟导线在平差中应用的专项资金，促使各项研究可以顺利高效的完成任务。
第二，培养技术型人才。在合适的时间、适当的阶段要做好人才的定期培训。加大对荧光定量PCR技术应用工作的资金支持，积极鼓励相关人员进行培训，派遣相关专家进行对员工进行讲座知识培训。同时要积极组织好大家对荧光定量PCR技术应用理论知识的学习，除此之外，也要结合实际和具体的案例进行分析，开展实地演练，只有在平时更多地练习，做好技术总结和经验的把握才可以为以后工作的运行做好更多的铺垫，为以后解决困难提供更多的帮助。
第三，促进信息技术在荧光定量PCR技术应用方面的应用。实现荧光定量PCR技术应用的信息化是目前我国发展的一大趋势，信息技术可以更好地促进荧光定量PCR技术在环境微生物检测中的应用，提高工作效率，帮助平差测量技术的进一步提升，从而实现研究事业的发展。
四、结语
荧光定量PCR技术在环境微生物检测中的应用还有很大的发展空间和发展前景，需要相关人员在实际操作过程中积极探索，不断创新，实现荧光定量PCR技术的进一步发展。
参考文献：
[1]张靖雯.荧光定量PCR技术在环境微生物检测中的应用研究[J].智库时代,2017(05):143-144.
[2]王宇,靳伟东,兰凯,刘天尧.荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用[J].中国卫生标准管理,2015,6(30):151-152.