摘要：为了对猪繁殖及呼吸综合征病毒的冻干疫苗，在具体生产阶段的支原体检验体系进一步完善，本文展开对冻干疫苗的支原体检验工作，通过采用DNA荧光染色、PCR技术，对疫苗生产不同阶段进行检验，证实这两个技术方法的技术可行和优势。发现两种检测技术均可以获得可靠的疫苗支原体检验结果，提高支原体检出率确保冻干疫苗的生产质量。
关键词：冻干疫苗；支原体检验；DNA荧光染色；PCR技术
支原体作为无细胞壁的原核微生物，能够经细菌过滤器，实现无细胞人工培养基内部的生长繁殖。我国有关法律条例明确指出，活疫苗必须确保不存在支原体污染，对疫苗支原体检验的研究也逐渐增加。[1]目前被应用于支原体污染检测的方法，包括了PCR、DNA荧光染色、生化检测法、免疫结合实验、分离培养法等多种方法。本文将针对DNA荧光染色和PCR技术，应用于冻干疫苗支原体检验工作展开研究。
1材料与方法
1.1材料
选用Marc-145细胞、猪繁殖及呼吸综合征病毒的冻干疫苗（PRRSV），DNA荧光染料、支原体检测试剂盒，首先准备本次研究所需样品，培养Mare-145细胞备用，取出PRRSV种毒，细胞接种培养3~5d之后，抽取15~25瓶的PRRSV半成品抗原液，接种细胞培养3~5d。取样成品疫苗取接种细胞完成3~5次传代备用。[2]
1.2方法
（1）DNA荧光染色，在进行该染色操作中，具体操作标准以《中华人民共和国药典》作为主要依据[1]，进行固体液、封固液以及DNA荧光染料的配制。
（2）检测Marc-145细胞、PRRSV种毒。在这一检测环节首先去除细胞培养瓶中的培养基，然后将6ml固定液加入其中，在5~10min之后重新更换固定液，重复5~10min。经过一段时间风干处理之后，将共计6ml的DNA荧光染色液加入其中，形成正常室温条件下的0.5h染色，并进行反复3次确认后，采用蒸馏水进行冲洗，然后加入风干后的封固液，处理后使用荧光显微镜，对具体结果仔细观察记录。
（3）PCR检测，以支原体检测试剂盒使用说明书为依据，进行PCR检测，同时对PCR的产物采用琼脂糖凝胶电泳完成检测。[4]
（4）培养法，依照《中华人民共和国兽药典》其中操作标准，完成对成品疫苗支原体检验工作。
2结果
2.1DNA荧光染色检测结果
通过在检测中完成Marc-145细胞的复苏传代培养之后，在运用DNA荧光染色检测方法，发现不存在细胞核外部荧光染色，该情况发现并不存细胞支原体污染问题，与细胞库培养法的最终检测结果存在一致性（见图1）。对PRRSV种毒实现Vero细胞接种，运用DNA荧光染色法检测，该结果也反映出细胞核内着染荧光，表示PRRSV种毒本身并未发生支原体感染情况，与细胞库培养法的最终检测结果存在一致性。在进行PRRSV半成品抗原液检测时，经监测内部支原体感染情况，能够发现15~25瓶取样检测中，最终检测结果表示，其中有4瓶呈现阳性检测结果，另外还存在4瓶疑似阳性检测结果，所以这一批PRRSV半成品抗原液废弃。除此之外3批半成品疫苗中存在疑似单瓶支原体阳性检测，完成剔除之后应用于培苗，9批成品后检测支原体完成后结果均合格。对PRRSV成品疫苗内的支原体进行检测，按照上述方法染色后经观察，通过荧光显微镜显示出其中存在3批成品疫苗内有大量核外荧光，不同于PCR检测的阴性，这表明DNA荧光染色阳性结果，且一致于细胞库培养检测结果。
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图1 DNA荧光染色法检测Marc-145种细胞
2.2PCR检测结果
对成品疫苗提取检测样品后展开PCR检测，检测结果表明仅仅在第1个批次，最终获得的检测结果和另外两种不同，该批次运用DNA荧光染色及培养法检测均为阴性，但PCR检测结果为阳性。三种检测方法的最终结果（见表1）。
表1 三种检测方法疫苗支原体污染检测结果对比
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3讨论
DNA荧光染色检测法应用于冻干疫苗支原体检验，目前已经作为一项比较成熟的技术，以往文献研究中通过运用DNA荧光染色法，对HCV、JEV、以及PRRSV冻干疫苗，检测结果发现完成冻干PRRSV疫苗定容接种，对于病毒不敏感Vero指示细胞，由于疫苗接种量适量，并且PRRSV也未发生细胞病变，因此对假阳性结果有效减少。以往研究中提出培养猪鼻支原体培养难度较大，在检测过程中采用DNA荧光染色法的检出率较培养法明显高。在《中华人民共和国兽药典》中有关半成品检验支原体的项目要求，假若半成品抗原液未进行支原体检测，那么便会存在支原体污染所致疫苗纯净性检验不合格情况。PCR检测技术本次结果为阳性，能够拥有更高检测敏感性。
总而言之，DNA荧光染色可以在6d之内得到半成品支原体检验结果，用时接近于剩余半成品的检验项目时间。而在DNA荧光染色检测结果为阴性时，PCR技术科检测阳性拥有更高检出率，但是DNA荧光染色操作更经济便捷，
参考文献
[1]钟天鹰, 毛志红, 张其华. 荧光定量PCR法检测呼吸系统感染儿童肺炎支原体DNA的分析[J]. 临床儿科杂志, 2002, 20(3):137-139.
[2]张磊, 郭桂林, 张如, et al. 实时定量PCR和ELISA检测支原体感染在儿童肺炎诊断中的应用[J]. 中国卫生检验杂志, 2014(13):1906-1908.
[3]靳蒙蒙. 猪肺炎支原体荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D]. 南京农业大学, 2012.
[4]刘晋平, 贾丽艳, 姜俊兵, et al. 检测兽用疫苗中支原体污染的PCR-ELISA技术的建立及应用[J]. 农业生物技术学报, 2007(01):106-110.