天然抗氧化物滴眼液对实验性小鼠干眼的治疗作用

发表时间:2020/4/15   来源:《中国医学人文》2019年10月10期   作者:金海燕 李正日 李承霖 汝新宇 邓文庆 :李英俊通讯作者
[导读] 探讨紫苏提取物和透明质酸(HA)混合物滴眼液对实验性干眼(EDE)小鼠模型的治疗作用。
 
金海燕 李正日 李承霖 汝新宇 邓文庆 :李英俊通讯作者
(延边大学附属医院眼科;吉林延吉133000)
 
 
 
摘要:目的:探讨紫苏提取物和透明质酸(HA)混合物滴眼液对实验性干眼(EDE)小鼠模型的治疗作用。方法:采用0.1%紫苏提取物和0.1%透明质酸(HA)混合滴眼液对实验性干眼小鼠进行治疗。在干眼模型诱发后10天,测量泪液量、泪液破裂时间(BUT)和角膜荧光染色评分。此外,我们还采用多重免疫珠法测定了10天时结膜中白细胞介素(IL-)1β、肿瘤坏死因子(TNF-)α的水平。结果:采用0.1%紫苏提取物和0.1%透明质酸(HA)混合滴眼液治疗小鼠,其各项临床指标均较单纯用HA治疗小鼠有明显改善。与其他组相比,和0.1%透明质酸(HA)混合滴眼液组的IL-1β、TNF-α和细胞外活性氧产生均显著降低(P<0.05)。
结论:局部应用紫苏提取物与透明质酸混合滴眼液可改善实验性干眼小鼠模型眼表的临床症状,减轻炎症,改善氧化应激标志物和ROS生成。紫苏提取物和透明质酸混合物对干眼症的临床症状和炎症有较大的治疗作用。
 
关键词:天然抗氧化物;紫苏提取物;干眼症;动物模型
 
1.引言
干眼症是患病率最高的眼表疾病(1)。我国北京市干眼患病率约为21%(2),上海地区约为15%一30%(3,4),在西部干燥和高海拔地区,其患病率高达31.93%一52.4%(5,6)。随着环境污染的加重及电子屏幕的广泛应用,干眼的患病率逐年上升且年轻化(7),给人们的工作和生活造成明显影响,并可能严重危害患者的视功能。干眼的发病机制繁杂,发病机制不明确。最近的研究成果发现:氧化损伤能够激发炎症反应并共同参与了干眼的发病。氧化应激产生活性氧(ROS)(8-10),可导致角膜和结膜上皮细胞DNA的改变和损伤(11),受损上皮细胞释放细胞因子并导致眼表炎症,导致干眼症。
紫苏 Perilla frutescens (L.) Britt. 为唇形科一年生草本植物,是我国传统的解表药之一,中国大部分地区均产。紫苏含有大量的α-亚麻酸(Omega-3脂肪酸的植物版本),以及亚麻酸(Omega-6)和油酸(Omega-9),这些都是不饱和脂肪酸,使得紫苏有着强大的防止动脉硬化的作用,更具有强大的抗氧化能力,清除自由基,维系细胞的“青春寿命”。
人工泪液是干眼症的常见治疗方法。透明质酸(HA)是由N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸的重复二糖单元的长链组成的线性聚合物,是润滑剂滴眼液的成分之一(12)。这些药物不仅可以缓解干眼症状,还可以改善角膜表面完整性。然而,单独使用HA滴眼液可能无法解决干眼症的病因。
虽然已发现紫苏提取物具有抗炎及抗氧化及作用,但尚未探索紫苏提取物和HA联合应用于干眼症。本研究采取随机单盲原则,选取国际上通用的干眼小鼠模型,并加以改良,用来探讨紫苏提取物和HA混合物对干眼治疗效果和机制。
 
2.方法
2.1. 干眼症的老鼠模型
该研究在实验中使用6至8周龄健康雌性C57BL / 6小鼠60只,体重(20±2)克,上海斯莱克动物责任有限公司提供。通过每天四次(上午9点,下午1点,下午5点和下午9点)用0.5mg / 0.2mL氢溴酸东莨菪碱(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)皮下注射小鼠来诱导实验性干眼(EDE)模型。暴露于空气通风和30%的环境湿度(13,14)。在这些实验期间,动物的行为,食物和水摄入不受限制。
所有动物相关实验操作均遵守ARVO关于眼科研究中实验动物使用的规定
2.2. 材料
纤维素酶法提取苏子叶中黄酮类化合物。将苏子叶晾干,粉碎40-60 目,准确称取5.0000 g 置于锥形瓶中,加入200mL 的蒸馏水,浸泡24h,将pH值调至4.5-6.5,加入纤维素酶放入恒温水浴锅加热,一段时间后将其取出抽滤,滤液在60℃以下加热,待将要得到膏状物质时,停止加热,用平衡盐溶液(BSS,Alcon,Fort Worth,TX)稀释。
2.3. 实验设计和程序
将小鼠随机分成5组,用如下的局部提取物处理:(1)未处理的对照(UT),未暴露于干燥胁迫或局部处理;(2)EDE干眼诱发组,暴露于干燥压力,但不接受滴眼液;(3)用0.1%透明质酸(HA; Alcon Korea,Seoul,Korea)治疗的EDE小鼠;(4)用0.01%紫苏提取物和0.1%HA混合物处理的EDE小鼠;(5)用0.1%紫苏提取物和0.1%HA混合物处理的EDE小鼠。每组由10只动物组成。所有治疗组每天四次接受3mL滴眼液。在处理后10天测量泪液体积,泪膜破裂时间(BUT),角膜荧光素染色评分和角膜不规则评分。在评估临床参数后,对小鼠实施安乐死,并进行多重免疫珠测定,酶联免疫吸附测定(ELISA)。
2.4.泪液体积测量。
如前所述[13,15],使用酚红浸渍的棉线(Zone-Quick,Oasis,Glendora,CA,USA)测量小鼠的泪液体积。简而言之,将棉线施加到外侧眼角上20秒,并且使用显微镜(SMZ 1500,Nikon,Melville,NY,以下测量,以泪液变成红色线的毫米数表示的泪液体积美国)。构建标准曲线以将距离转换为体积。
2.5. 泪膜破裂时间(BUT)和角膜荧光素染色评分的评价
在将1%荧光素(1mL)滴注到下结膜囊中后,让小鼠眨眼三次,然后使用在钴蓝光下的裂隙灯生物显微镜(BQ-900,Haag)以掩蔽方式在几秒钟内记录泪膜BUT 。
2.6. 多重免疫珠测定,酶联免疫吸附测定(ELISA)
如前所述,多重免疫珠测定法(Luminex 200; Luminex Corp,Austin,TX)测量结膜中白细胞介素(IL)-1b,-17和干扰素γ诱导蛋白(IP)-10的浓度。(16-18) 收集组织并合并在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中30分钟。将细胞提取物在4℃下以10,000g离心10分钟,并将上清液储存在-70℃直至需要。将等份的上清液加入含有适当细胞因子珠混合物的孔中,所述细胞因子珠混合物包括对IL-1b,-17和IP-10特异的小鼠单克隆抗体(Panomics,Santa Clara,CA)。在用分析系统(xPONENT,Austin,TX)添加链霉抗生物素蛋白 - 藻红蛋白后检测反应。从已知浓度的重组小鼠细胞因子的标准曲线计算组织中IL-1β,TNF-α的浓度。使用ELISA检测脂质过氧化标记物,己酰基-ly(HEL)和4-羟基壬烯醛(4-HNE)的总蛋白质水平。收集上清液并使用ELISA试剂盒测定HEL(JaICA,Haruoka,Japan)和4-HNE(Cell Biolabs,San Diego,CA)。根据制造商的说明分析样品。(19–21)
 
3.统计分析
所有资料录入SPSS21.0统计软件,采用计量资料的单因素、多因素的方差分析进行统计学分析。描述性统计值用平均值+标准差表示。对各项指标,在满足方差齐性时,采用Turkey 显著性检验进行多重比较:方差非齐时,则采用t检验。所有数据以平均数及标准差表示,以P<0.05为差异具有统计学意义。
 
4.结果
4.1 各组小鼠泪液分泌结果
在造模后的第5,10天,泪液分泌量指标上,EDE组较正常对照组均减少,差异具有统计学意义(P<0.004),且从造模后第一天开始,随造模时间延长 EDE组的泪液分泌量随时间而逐渐减少,于10天时泪液分泌量达到最低,而正常组在不同时间点的泪液分泌量未有明显变化。治疗第10天时,在泪液分泌量(见表1)上0.1与0.01%紫苏提取物和0.1%HA混合物治疗组较EDE组及溶剂对照组明显延长,其差异有统计学意义(F=6.788,P=0.003)(F=5.608,P=0.008)。然而0.1%透明质酸治疗组较EDE组无明显改善。
 
 
 
4.2泪膜破裂时间(BUT)
治疗第10天时,在泪膜破裂时间(见表1)上0.1与0.01%紫苏提取物和0.1%HA混合物治疗组较EDE组及溶剂对照组明显延长,其差异有统计学意义(F=6.788,P=0.003)(F=5.608,P=0.008)。然而
0.1%透明质酸治疗组较EDE组无明显改善。
 
4.3多重免疫珠测定,酶联免疫吸附测定(ELISA)
与其他组相比,和0.1%透明质酸(HA)混合滴眼液组的4HNE、TNF-α和细胞外活性氧产生均显著降低(P<0.05)。
 
 
5.讨论
目前,干眼的治疗手段主要为药物治疗,包括人工泪液、抗炎药物、促泪液分泌药物等,而人工泪液作为干眼治疗的一线药物,由于其不包含正常泪液中的包含的多种活性因子成分,仅能润滑眼表,而对于角膜上皮缺损修复的帮助有限。对于中重度的干眼患者,则常常角膜上皮缺损。因此寻找一种全新的治疗药物,对治疗中重度干眼就要有重要意义。 既往的研究发现,氧化还原反应/氧化反应的不平衡会导致核酸、碱基、脂类、蛋白质和碳水化合物的过氧化,从而导致包括干眼在内的眼表疾病的机制[23]。此外,许多抗氧化剂已经显示出对人角膜上皮细胞以及干眼患者的干眼的有益作用[16]。Li等(13)应用Omega-3治疗实验性小鼠干眼。通过对比症状,及实验室检查结果,发现小鼠眼表上皮细胞及杯状细胞密度显著上升、细胞凋亡数量下降,氧化物之及炎症因子减少。但是,抗氧化药物的制备和保存的流程繁杂,临床推广有诸多限制。因此,一种可以稳定泪膜,缓解干眼症状、减少眼表炎症和抗氧化物质,又可以促进角膜上皮修复的药物在干眼治疗上有着积极的意义。
紫苏中的挥发性成分、黄酮类成分和酚类成分是紫苏的主要有效成分。植物提取物中含有的多酚可以缓解人类的眼睛疲劳。紫苏中含有丰富的多酚类化合物,具有较高的抗氧化活性,增加内皮细胞中抗氧化酶mRNA 和蛋白表达水平[24]。有研究显示紫苏叶花色苷具有比单纯的紫苏水提物更高的抗氧化能力,对DPPH·和 ABTS + 自由基均有良好的清除作用 (25) 。紫苏提取物还具有抗炎作用。紫苏总黄酮能降低气囊炎模型小鼠血清中细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、炎症部位一氧化氮(NO)的量,从而降低减轻因子、氧自由基对机体的攻击损伤 [26] 。紫苏水提物具有很强的抗特应性皮炎的活性,可迅速降低 2,4-二硝基氟苯所诱导的小鼠耳肿胀度,降低邻近皮肤组织的嗜酸性粒细胞水平 (27)。
同时,HA促进角膜上皮增殖和迁移,稳定眼表上皮屏障,具有创伤愈合特性。(28,29)此外, HA 还可以在控制局部炎症方面发挥重要作用。(30,31)根据干眼病的人体研究,HA抑制炎症标志物,包括HLA-DR和CD40,并上调保护性标志物MUC5AC和CD63。(32) 这些HA 的伤口愈合和控制炎症的特性可能会改善角膜染色, 减少促炎细胞因子。紫苏提取物的抗炎及抗氧化作用已被证实。同时HA是眼科最长用的人工泪液的主要成分,但是紫苏提取物和HA混合物对干眼的治疗作用及有关机制迄今没有报道。
在我们的实验结果中发现,相较于其他组,0.1%紫苏提取物和0.1%HA混合物泪液分泌增加,泪膜破裂时间延长,角膜表面不规则不规则形接近正常,角膜上皮细胞数量及结构上趋于正常。这与Li等(13)应用Omega-3治疗实验性小鼠干眼的结果基本一致,表明了紫苏提取物和HA混合物对实验性干眼有改善症状的作。
治疗中重度干眼时,回复角膜上皮屏障功能,减少眼表炎症及氧化物质,促进角膜上皮修复尤为重要。活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)在干眼周期中起中心作用。各种上游因素如年龄、污染物、紫外线等可能会瞬间增加泪液和眼表的ROS负荷。当ROS水平升高时,各种抗氧化蛋白/酶被上调,这可能产生负反馈从而提升应激信号的程度或ROS的水平。未拮抗的ROS可直接损伤眼泪脂质层等结构以及眼表神经的髓鞘,从而导致干眼的各种过程。因此,抗氧化防御对于保持ROS水平低于诱导过度应激信号的水平至关重要。同时,在干眼患者中,晚期脂质过氧化标志物羟基壬烯酸(4-hydroxynonenal,HNE)和丙二醛(malondialdehyde,MDD)的表达与无干眼的类似患者相比,在泪膜和眼表中增加。IL-1β作为重要的炎症因子,它既可以引起发热,又可以促进其他的炎症因子,比如IL-6、IL-8和TNF-α。已有研究表明IL-6、IL-8和TNF-α在干眼患者的泪液中表达增高,也有研究表明IL-1β在干眼患者泪液和结膜中表达增加。
0.1%紫苏提取物和0.1%HA混合物治疗组结膜中IL-1β、TNF-及4-HNE表达显著下降。这可能与紫苏提取物和HA混合物促进角膜上皮修复,维持泪膜稳定,润滑眼表,且本身就有的抗炎和抗氧化的左右,避免了眼表长期处于慢性炎症状态,阻断了角膜上皮病理性角膜化的过程。
综上所述,本研究证实了紫苏提取物与HA混合物滴眼液对干眼症的疗效。紫苏提取物通过保护免受氧化应激,抑制炎症标志物的表达,减弱氧化损伤,减少暴露于干燥应激的小鼠眼表中的氧化物质的产生和炎症。再加上HA伤口愈合和控制炎症及润滑剂的特性,这两种成分的混合物将协同作用, 有助于改善干眼症的症状和体征。因此,紫苏提取物与HA混合物滴眼液的局部应用可以是用于治疗患有干眼症患者的替代治疗选择。
 
 
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