摘要：生物制造是指以微生物细胞工厂的人工设计和开发为基础，以可再生资源为底物，以环境友好型生物炼制过程为生产模式的技术体系，其以绿色、经济、可持续的特点逐渐成为社会经济新发展模式的重要选择和全新动力。
关键词：生物炼制;细胞工厂
引言
化学品制造行业在消耗不可再生资源的同时，还对生态环境造成了破坏，这给以可再生资源为原料的生物制造带来了发展机遇。“细胞工厂”除了反应条件温和，还具有较强的可塑性。
1关键元件的挖掘及功能鉴定
随着人类对地球物种认知的扩展(尤其是对深海、沙漠等极端环境物种的研究)以及对天然化合物分离纯化及鉴定水平的不断提高，天然产物库中的化合物数量飞速增加。可惜对于绝大多数具有生物活性的天然产物而言，决定其生物合成的众多基因元件都不清楚，因此，挖掘出合成途径中的关键基因元件尤为重要。根据一般的化学反应原理及已知的中间体结构并辅以同位素示踪，可推测可能的生物合成途径。对生物合成途径的合理推测有助于挖掘催化反应元件，其传统挖掘方法是以突变体库的筛选为典型代表。人工构建或者天然存在的一些表型不同的突变体是发现关键催化元件的良好素材。在燕麦中存在一种突变体Sad2，可以积累大量的β-amyrin，这暗示在皂苷合成途径中由于上游的基因发生突变，造成β-amyrin不能被催化转化为相应的萜类和皂苷。随着高通量测序技术的快速发展，越来越多物种的基因组被测序，但从海量的基因组信息中筛选出可能参与特定天然产物生物合成的元件依然是一项挑战性工作。在漫长的进化过程中，生物体为更经济地应对环境变化，形成了严谨的调控网络，同一产物生物合成途径中的基因往往受到统一的调控而具有相似的表达谱。在共表达特征基础上再结合代谢组的分析，可以有效地缩小特定途径候选基因的筛选范围，有效地提高后续元件挖掘的效率。如通过破解黄瓜的基因组数据，并结合代谢组学、比较基因组学等，最终发现9个与黄瓜中葫芦素C合成相关的基因，并鉴定了其中4个酶的功能，破解了黄瓜苦味合成及调控的机制，为三萜葫芦素的生物合成奠定了重要基础。Lau和Sattely通过对植物盾叶鬼臼的转录挖掘，确定了29个候选基因，从中鉴定了6个和鬼臼毒素生物合成相关的基因。从219个灵芝P450基因中确定了可能参与灵芝酸生物合成的82个候选P450基因，随后借助酵母筛选平台，发现了参与从羊毛甾醇后修饰生物合成灵芝酸的一个关键基因元件CYP5150L8。这不仅打开了解析灵芝酸后修饰途径之门，也为其合成生物学生产奠定基础。相信随着测序技术的不断进步以及各种筛选方法和检测手段的发展，为通过合成生物学技术智能制造目标产物奠定物质基础。
2途径设计
与石化工厂中某个化学品单一的生产线不同，细胞工厂是一个多种化合物和生化反应共存的混合体，所有这些化合物组成一个复杂的代谢网络，它的本能是满足细胞自身的生存和分裂。要在这么复杂的体系中合成目标化学品，首先需要设计一条最优的合成途径。途径设计有两种方法，一种是基于已知的生化反应途径进行设计，这方面有许多可供参考的数据库，例如综合了基因、酶、化合物、生化反应和代谢途径的KEGG数据库，以生化反应数据为基础的BRENDA数据库，以及整理了各种生物基因的功能与调控的数据库Metacyc等；另一种是在已有认知的基础上，通过建立代谢网络模型，进行合理的推测，该方法主要应用于新合成途径的设计与构建。目前已有许多模型建立，例如RDM方法、PPS系统结合UMBBD数据库和BNICE框架结合ATLAS数据库等。
所有这些方法均通过设定一些规则来计算得到新的反应和代谢途径，其中PPS系统是基于已知的生化反应数据库来演算，其生化反应的预测规则存在局限；RDM与上述方法则不同，它基于化合物的分子结构进行推演，结果具有更广泛的预测性，但可靠度有所降低；同样是基于已有的数据库来演算，BNICE框架采取了多样性的规则来囊括已有的生化反应和预测新的生化反应，从而使其能够更加有效地预测新的生化反应和代谢途径。
3细胞工厂的构建技术
发现和认识微生物代谢的分子基础、互作关系及调控机制，为微生物细胞工厂的构建奠定理论基础。更重要的是要进一步了解、掌握生物合成系统的构建原理，开发出不同途径的组装策略以及遗传改造方法。转基因是生物合成能力重构的重要手段，外源基因可以赋予细胞新的能力、形成新产物的合成、增强细胞的抗逆性等，是细胞工厂构建的有力工具。同时，为了优化特定产品的合成途径，需要去除一些不必要的支路途径，将细胞的物质流与能量流引向目的代谢物途径。为了实现这些目标，必须解决外源基因的导入、基因的敲除、大片段基因的重组和目的基因的表达等一系列技术问题。董红军、李寅等作者介绍了丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统研发方面的所取得的新进展。作者通过二型内含子的方法失活丙酮丁醇梭菌的限制修饰系统，实现了非甲基化质粒在丙酮丁醇梭菌中的转化。作者进而分析了基于非复制型质粒的同源重组、基于复制性质粒的同源重组、反义RNA技术和二型内含子基因失活技术目前存在的缺陷，指出提高转化效率是丙酮丁醇梭菌遗传操作系统改造的关键突破口，并对如何发展丙酮丁醇梭菌的高效遗传操作系统提出了建议。微生物的DNA转化方法是导入外源基因的工具，目前对微生物转化主要有化学法和电转化法。这些方法存在感受态细胞准备时间长、处理过程容易导致细胞活性降低、处理后要有温育等缺点。谭海东、赵宗保等作者开发了一种基于海泡石的微生物DNA转化的方法。海泡石是一种矿石纳米材料，价格便宜、来源丰富，且对人体无害。这种转化方法无需感受态制备和处理后的温育过程，可得到比钙转更高的转化率。该方法也可用于探索其他用钙转和电转未成功的微生物，从而拓宽了生物炼制细胞工厂的来源。基因组混组是一种新的细胞工厂改造方法。通过循环原生质体融合等手段，使得不同菌株来源的基因组能够得到充分重组，增加将正向突变整合到同一重组子中的机会。杨俊杰、杨晟等作者考察了枯草芽胞杆菌多轮融合过程中基因组混组程度改变的影响。通过比较天蓝色链霉菌、乳杆菌基因组混组的结果，并结合计算机模拟循环融合过程，作者指出，要达到较充分的枯草芽胞杆菌基因组混组效果，需要以突破微生物细胞间高频重组操作技术为基础。细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。细菌启动子在基因转录水平的调控上起着重要作用，直接决定蛋白的表达水平，这使得细菌启动子在全细胞催化和酶催化领域具有巨大的应用价值。
结语
随着合成生物技术的进步，将会有许多表达元件与调控手段被开发，这些工具也将逐步被应用于人工合成“细胞工厂”的构建与优化。
参考文献
[1]白雪,赵晶晶,王倩,等.丙酮丁醇梭菌磷酸化蛋白质组分析.生物工程学报,2010,26(10):1357 1362.
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[3]杨俊杰,范文超,肖晗,等.枯草芽胞杆菌基因组混组方法.生物工程学报,2010,26(10):1385 1392.