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摘要：以标准菌株大肠埃希氏菌ATCC 25922为研究对象，用GB 4789.2-2016 菌落总数测定为参照方法，进行GB 15982-2012物体表面菌落总数方法验证。通过估计偏差验证、重复性实验、重现性实验，可证实GB 15982-2012中物体表面菌落总数达到预期要求。
关键词：大肠埃希氏菌；菌落总数；验证
引言：
有关微生标准的方法验证有很多文件，老师们在标准里面教我们怎么去做微生物的方法验证，但做微生物方法验证并公开出来的很少，导致微生物方法验证具体怎么做没有太多参考。因此，我就该标准进行方法验证，并写出此文以供有需要的朋友参考，如有不合理或错误之处，请各位老师不吝赐教！
1 材料与方法
1.1实验主要仪器和设备
培养箱：上海茸研LRH-400F、上海三发 BSP-400；蒸汽灭菌器：上海博讯 YXQ-LS-100A、YXQ-LS-75G；电热鼓风干燥箱：上海博讯 GZX-9240MBE
1.2实验用标准菌株
大肠埃希氏菌 ATCC 25922
1.3实验用培养基和试剂
营养琼脂（NA）；平板计数琼脂（PCA）；氯化钠；脑心浸出液肉汤（BHI）
1.4实验方法与步骤
1.4.1估计偏差验证
1.4.1.1验证标准方法
（1）取标准菌株大肠埃希氏菌 ATCC 25922用BHI复活，稀释菌悬液浓度高、中、低至可计数水平。
（2）将鉴定室紫外照射60min，消毒结束30min后开始采样。
（3）用无菌规格板放在被检物体表面，用浸有无菌生理盐水的棉拭子，在规格板内横竖往返各涂抹5次，连续采样1-4个规格板面积，剪去手接触部分，将棉拭子放入装有10mL采样液的试管中待检，做空白对照。
（4）稀释好的菌悬液分别取1mL，用无菌棉拭子均匀涂抹于桌面，如上采样作为标准检测样品。
（5）按标准GB 15982-2012中A.3.4检测方法开展实验，将冷却至40-45℃的NA倾注平皿，36℃培养48h。
（6）按标准GB 15982-2012中A.2公式计算结果
1.4.1.2参照方法
将NA换成PCA，其他同1.4.1.1方法
1.4.2重复性实验
在同一实验室检测同一物质，由同一操作者使用同一设备，按照1.4.1.1操作步骤做两次独立实验。
1.4.3再现性实验
在不同实验室检测同一物质，由不同操作者使用不同设备，按照1.4.1.1操作步骤做十次独立实验。
2 实验结果与结论
2.1 估计偏差结果与结论
表1 估计偏差检测数据
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2.2重复性实验结果与结论
表2 重复性实验结果
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2.3复现性实验结果与结论
表3 复现性实验结果
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3 实验结论
用大肠埃希氏菌ATCC 25922标准菌株，在估计偏差、重复性、复现性三个实验基础上对标准GB 15982-2012物体表面菌落总数进行方法验证。经实验数据分析表明：估计标准偏差的结果差值分别为0.10、0.02、0.02，均不大于0.5；重复性实验结果的绝对差值为0.08，小于重复性限值0.25；复现性实验结果的绝对差值为0.10，不大于复现性限值0.45，最终证实标准GB 15982-2012中物体表面菌落总数能达到预期要求。
参考文献：
[1]GB 15982-2012 中华人民共和国国家标准 医院消毒卫生标准
[2]SN/T 1800-2006/ISO 4833：2003 《食品和动物饲料微生物学-微生物30℃菌落计数方法》
[3]RB/T 033-2020 微生物检测方法确认与验证指南 RB/T 033-2020