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摘要：应用基因工程技术改变动物的基因，使其表型发生变化，就可以制得转基因动物。如今，转基因动物已成为构造人类疾病模型和验证新药的关键工具。此外，它们可以帮助科学家发现新的药物作用位点，验证和生产治疗性蛋白质。深入研究转基因动物的制作技术，有助于扩大转基因动物的应用范围，降低转基因动物的生产成本。本文详细分析了转基因动物的研究进展，深入探讨了转基因动物的应用，以期为相关人员提供参考。
关键词：转基因动物；研究进展；应用
1引言
现代生物学研究的主要方向之一是鉴定和表征脊椎动物基因的功能。在大约四十年前，科学家发现了一些克隆表达水平较高的基因的方法，他们尝试人为地改变这些基因的表达水平，从而研究这些基因的功能，这些科学家是转基因动物研究领域的先驱者。不过，当时的人们对调控基因表达的因子缺乏深入的了解，他们在构造过表达某一基因的动物模型时，成功率非常低。也就是说，那个年代的科学家构造转基因动物模型时，几乎无法按照自己的意愿调节基因表达的水平。
在后续的转基因研究中，一些研究人员发现了调控基因表达的重要因子—微卫星序列，这极大地推动了基因表达调控技术的发展。同时，各个国家的基因研究人员相互合作，共同完成了对某些物种（如小鼠）的基因组序列的测序。科学家在研究微卫星序列和基因测序结果的过程中，对脊椎动物中保守基因的功能有了更深入的认识，这在一定程度上加速了鉴定人类疾病相关基因的进程。例如，科学家可以对同一家族中不同成员的囊性纤维化相关基因的微卫星序列进行研究，如果这些序列与其他遗传标记存在一定的相关性，那么这些微卫星序列可能具有调节相关基因的表达的功能。应用这种方法，研究人员成功地鉴定了囊性纤维化跨膜电导调节剂（CFTR）基因，找到了一些可能导致囊性纤维化的突变。在明确相关基因的功能后，科学家可以在相关基因的上游或下游添加特定的序列，高效地对动物的基因进行改造，从而获得性状不同的转基因动物。
此外，一些科学家尝试使用乙基亚硝基脲等化学诱变剂，使小鼠产生随机的基因突变。在这个过程中，许多基因的序列都可能发生变化。可以说，这种化学诱变的方法，是一种高效地获得大量转基因动物的方法。在研究这些含有随机突变的小鼠的过程中，科学家发现，一些基因在发生突变后，不能表达出原有的产物，这会导致小鼠的表型发生变化。一些科学家通过对比野生型小鼠和突变型小鼠的基因序列，鉴定了一部分可能影响突变的基因。此外，他们对小鼠基因组和表达的序列标签进行了较为系统测序，评估哪些突变可能会影响小鼠的性状。可以说，应用随机诱变技术制作的转基因动物是鉴定基因功能的强大工具。
以上几种转基因方法是原始而相对低效的。几十年来，科学家对转基因动物的制作技术进行了深入的研究，他们致力于提高基因表达的稳定性、降低转基因动物的制作难度和制作成本。今天，价格适中的转基因动物在许多领域都有着十分广泛的应用。它们可以被用于生产重组蛋白质、改造猪器官、提高动物的产奶量和生存能力等。从生理学和分子生物学的角度，对转基因动物的制作方法进行深入的研究，有着非常重要的意义。
2.制作转基因动物过程中的常见问题
科学家在获得转基因动物的过程中，遇到了一系列问题：一些幼年的转基因动物在生长的过程中表现出与老年动物相似的特征，其寿命也大大缩短；导入的基因可能会随着细胞的分裂而丢失，导致一些动物无法高效地表达外源性基因；具有特定功能的转基因动物的制作成本居高不下；转基因动物的规模化生产技术不成熟，等等。这些问题可能会影响转基因动物在许多领域的应用。如何根据动物学基础研究成果提高转基因动物的品质，降低转基因动物的制作成本，是生物学家面临的主要挑战之一[1]。
3.转基因动物的研究进展
如何高效地将目的基因转入受体细胞，使其在受体细胞中稳定表达，是科学家面临的重要挑战。多数生物学家认为，在制作转基因动物时，最重要的技术是随机DNA整合技术。深入研究随机DNA整合技术，有助于提高转基因操作的效率，降低转基因动物的制作成本。
一些科学家尝试将外源DNA导入动物细胞，使之随机插入动物细胞的基因组中，从而获得转基因动物，这就是随机DNA整合技术。小鼠、大鼠、兔子、猪、绵羊、牛和猴子等常见的实验动物的细胞都具备整合外源DNA的能力。在构建这些实验动物的转基因模型时，科学家可以应用随机DNA整合技术，高效地获得大量的突变体。除这些动物外，秀丽隐杆线虫、果蝇、非洲爪蟾和墨卡达卡鱼等经典的模式动物也能够将外源DNA整合到自身的基因组中的能力，科学家可以应用随机DNA整合改造这些动物的性状，使之符合科研或实际应用的要求。随机DNA整合技术的应用成本相对较低，在制备大量的基因型不同的转基因动物时，人们通常会选择随机DNA整合技术。下面，笔者将详细探讨几种经典的随机DNA整合技术[2]。
3.1DNA显微注射法
1980年，一些研究人员发现，在显微镜下将线性DNA片段注射到单细胞胚胎的原核中，就可以将外源基因导入哺乳动物，应用这种方法，他们成功地制备了转基因小鼠。今天，DNA显微注射仍然是最常用的转基因动物制作技术。不过，DNA显微注射有一定的局限性。在制作转基因兔、转基因大鼠和转基因猪的时候，DNA显微注射的效率是有限的。此外，DNA显微注射几乎不能用于制作转基因反刍动物，因为成功率非常低。这是因为，反刍动物的繁殖速度非常慢，可用胚胎的数量是非常有限的。此外，在反刍动物中，外源DNA整合的频率低于其他哺乳动物。
在对不同物种进行基因操作时，DNA显微注射的效率有一定的差异，这种差异似乎与显微注射技术本身无关，它可能与不同物种基因组整合外源DNA的能力的差异有关。高浓度的外源DNA是有毒的，而低浓度的外源DNA无法很好地发挥转基因作用。注射到小鼠胚胎中的最佳DNA浓度为1至2ng/μL。在兔和猪中，转基因的效率会随着DNA浓度的提高而逐渐提高，当DNA的浓度为2至8ng/μL时，转基因效率与DNA浓度存在线性关系。这个浓度范围大约对应1000–5000个基因拷贝。在导入较长的DNA片段时，科学家必须注入与短片段数量相同的DNA，才能保证转基因的效率[3]。
在对一些非哺乳动物进行转基因操作时，科学家可能很难在显微镜下看到这些物种的生殖细胞核。因此，他们只能先将DNA注射到细胞质中，然后诱导DNA进入细胞核。为了提高转化的效率，科学家必须注入大量的DNA（一般需要注入0.1~2×107个单位）。在获得转基因家禽、转基因非洲爪蟾时，该方法的成功率很高。不过，该方法对DNA的纯度有一定的要求。大量研究表明，用于注射的DNA必须有很高的纯度，才能得到纯合的转基因动物[4]。
一般而言，科学家需要进行琼脂糖电泳，才能从质粒或细菌的人工染色体（BAC）载体中分离相应的片段，从而得到高纯度的DNA.。他们通常不需要将溴化乙锭加入DNA中，就可以直接在紫外光下看到目标条带。在一些特殊情况下，研究人员可能需要向DNA中加入溴化乙锭，从而在凝胶的独立泳道中看到目标条带。应当用不会破坏DNA的UV光照射凝胶，然后切取目标条带，将其中的DNA回收、纯化后转入动物的受精卵或动物胚胎。回收DNA通常有一定的难度，只有具备丰富经验的技术人员才能高效地从凝胶中回收DNA。近年来，一些生物技术公司开发了一些分离、回收DNA的试剂盒，一些含有特殊化学成分的色谱柱能够帮助研究者从凝胶中高效地分离DNA片段，其应用十分广泛。
在某些情况下，科学家必须从BAC中分离较长的DNA片段，他们需要在电泳后用琼脂糖酶消化琼脂糖。商用琼脂糖酶的活性并不稳定，在不同的温度下，琼脂糖酶的催化效率有一定的差异，这可能导致琼脂糖分解不充分，影响制得的DNA的纯度。因此，在使用新购入的琼脂糖酶时，研究人员通常需要在使用前测试其活性。在确定琼脂糖酶的活性后，他们需要在过滤器上对琼脂糖进行透析，以消除琼脂糖消化产物。此外，还需要添加多胺（如亚精胺），使较长的DNA片段保持稳定[5]。
在处理较长的DNA片段时（如质粒片段），科学家也可以应用琼脂糖凝胶进行电洗脱。洗脱的物质将被截留在过滤器中，加入特定的洗脱剂，即可把DNA从过滤器中洗脱出来。电洗脱法非常简单，并且可以产生高纯度的DNA片段。在后续的评估中，研究人员可以应用分光光度计测DNA的浓度，判断其是否可以用于后续的转基因操作[6]。
分离的质粒片段可以冷冻数月，只要保存的方式是妥当的其性质不会发生变化，保存时间的长短不会对显微注射的效率有显著的影响。需要注意的是，较长的DNA片段必须保存在4℃，并且在保存数周后，其性质可能会发生一定的变化，转化的效率会受到一定的影响。在储存2或3周后，必须进行相关的测试，评估较长DNA片段的完整性。如果DNA片段是不完整的，那么它将不能被用于转染动物胚胎[7]。此外，科学家需要彻底清除任何含杂质的馏分，防止其对转化效率产生影响。
3.2 转座子法
转座子是可移动的DNA片段，它可以高效地促进基因整合。目的基因可以代替转座子的转座酶基因，提高转座的发生率，防止重组转座子以不受控制的方式传播。科学家可以向细胞中同时注射转座子、转座酶或编码该酶的基因，使转座子整合到基因组中。
转座子P是一种应用十分广泛的转座子。它可以用于生产转基因果蝇。此外，科学家还设计了一系列不同的转座子，它们能够高效地将目的基因高效地转移到许多物种中。在生产转基因蚕时，转座子Piggy Bac是很高效的，这为研究昆虫的科学家提供了新思路。研究表明，在进行转基因操作时，转入的细胞的外源性转座子不会与内源性转座子发生频繁的相互作用，并且它们不会在宿主基因组中移动，因此，应用这种方法形成的转基因动物通常具有较为稳定的表型。不过，转座子技术的局限性之一是每个转座子只能容纳长度为两千或三千个碱基（kb）的外源DNA[8]。此外，一些细胞会识别这些外源序列，导致转入的基因发生沉默。这会在一定程度上影响转基因的效率。各个国家和地区的科学家应当积极交流研究经验，分享研究成果，共同致力于改进转座子技术，提高基因转移的效率。
3.3病毒载体法
上世纪末，一些科学家在研究基因治疗的过程中，发现改良的逆转录病毒可以将外源基因导入患者体内，使患者更快地恢复健康。几十年来，风湿免疫科医生应用逆转录病毒载体疗法，已经成功地治愈了数万个患有先天性免疫缺陷病的儿童，他们无需长期停留在无菌房中，可以像普通的孩子一样在自然界中玩耍。不过，在上个世纪，用于基因治疗的病毒载体是非常昂贵的。随着病毒载体构建技术的发展，逆转录病毒载体的市场价逐渐降低，一些研究人员尝试借助逆转录病毒载体，将基因导入动物体内，从而获得具有特定性状的转基因动物。逆转录病毒载体最初被用于生产转基因鸡，后来科学家发现，它可以被用于生产转基因猴子和其他转基因哺乳动物，且目的基因通常能够在受体细胞中正常表达。然而，逆转录病毒只能作用于处于特定生长阶段的细胞，科学家需要用逆转录病毒同时感染数千甚至数万个细胞中，才能成功地实现转基因操作[9]。
慢病毒载体也是一种十分常见的病毒载体。应用慢病毒相关技术，科学家已经成功地产生了转基因鸡、转基因猪、转基因绵羊和转基因牛。慢病毒相关技术是较为简单的，即使操作者不具有丰富的经验，他也能高效地获得转基因动物。可以说，慢病毒相关技术比DNA显微注射或逆转录病毒相关技术容易得多。不过，慢病毒载体不能用于制作转基因猴动物模型，也就是说，人们无法应用慢病毒相关技术，在灵长类动物中模拟人类疾病。应用商业试剂盒，研究人员可以获得有效且安全的重组慢病毒颗粒，但是他们在完成相关实验时，必须足够小心。因为有些外源基因是癌基因，有些外源基因会影响细胞的增殖、凋亡或胞内信号转导，如果人们在操作时不够小心，导致这些病毒载体进入人体，那么外源基因将在人体中持续表达，导致细胞异常增殖、加速细胞凋亡或影响细胞代谢[10]。
4.转基因动物的应用
4.1建立人类疾病和药物筛选模型
在研究人类疾病的治疗方法时，科学家需要先在患有类似疾病的动物上开展相关研究，确认某一疗法是有效的、安全的，才能将其用于治疗人类疾病。利用转基因技术，科学家可以高效地建立疾病模型，筛选相关药物，为多种疗法的临床研究提供参考依据。
4.2研究基因的功能和作用
对基因的功能和作用进行深入研究，有助于人们理解多种疾病（尤其是遗传性疾病）的发病机制和人类进化的过程。应用转基因技术，科学家可以促进或抑制某一基因的表达，通过对比干预前和干预后动物的性状，判断基因的功能和作用。
4.3改良动物品种
在饲养动物的过程中，研究人员发现，一些动物不能很好地适应养殖环境，它们的生长速度较慢，繁殖能力下降。应用转基因技术，人们可以高效地将促进生长的基因和提高繁殖效率的基因转入动物体内，改良动物品种，使动物更容易适应不同的环境，提高动物的繁殖能力[11]。
5.结语
转基因动物研究自问世以来,经过世界各国科学家们的不懈努力,已经取得了辉煌的成就。可以说，转基因动物为人类社会带来了新的经济增长点。转基因动物的发展过程可能存在着一定的问题,但无可否认,转基因动物具有独特的优势,随着理论和技术的不断完善,转基因动物及其相关产品必将进入真正的产业化和市场化阶段,对人类的生产和发展起着推动性的作用。
参考文献
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[2]张芳.转基因动物及其产品检测技术研究进展[J].中国动物检疫,2020,37(12):73-80.
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