武帅
中国人民解放军总医院京北医疗区北清路门诊部 北京 100094
摘要：为了更好的检测人体血清中尿素含量，为临床医学，病情诊断提供技术支持，本文特别针对人体血清中尿素含量测定方法做出一定研究。本文建立ILD-LCMS/MS法相对于传统检测ID-GC/MS法前处理较为简单，过程得到简化。利用同位素稀释质谱法保证了该检测方法的准确度和溯源性，且利用括号法矫正质谱仪的波动，保证了数据处理的准确性。通过样本试验比对，证实了该方法的回收率和线性范围。最后通过测定两种浓度的血清标准物质，证实了该方法的可行性，为将来血清尿素标准物质的研究提供支持。
关键词：血清；尿素；LD-LCMS/MS；同位素稀释质谱法；
Determination of urea, uric acid and creatinine in human serum
Abstract: in order to better detect the urea content in human serum and provide technical support for clinical medicine and disease diagnosis, this paper makes a certain research on the determination method of urea content in human serum. Compared with the traditional id-gc / MS method, the ild-lcms / MS method is simpler and the process is simplified. Isotope dilution mass spectrometry is used to ensure the accuracy and traceability of the detection method, and bracket method is used to correct the fluctuation of mass spectrometer to ensure the accuracy of data processing. The recovery and linear range of the method were confirmed by the comparison of sample tests. Finally, the feasibility of this method was confirmed by the determination of two concentrations of serum reference materials, which provides support for the future study of serum urea reference materials.
Keywords: Serum; urea; ld-lcms / MS; isotope dilution mass spectrometry;
人体的血清中含有多种元素， 医学常用通过检测血清中元素的含量来检查病人身体健康情况。血清中尿素、尿酸及肌酐的测定能够给临床医学、病情诊断提供重要参考。目前用来测定血清中尿素、尿酸及酸酐的方式有很多，但为了检验结果的准确性，确立标准可靠地标准化参考方法。血清中尿素测量的液相色谱-同位素稀释串联质谱法原理可靠、前处理简单且定量准确，是目前血清中尿素测量较为重要的一种候选参考方法，本文通过设置实验，进行实验，验证结果的过称确定此方法的可行性，为血清中尿素标准检验物质提供数据支持。
1、材料与方法
1.1设备与试剂
1.1.1仪器的选择
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1.1.2血清样品
本次实验选择的血清样品是由军事医学科学院野战输血研究所提供的冰冻混合人体血清。血清标准物质为标准物质SRM909b标准I，人血清干粉，美国NIST。
1.1.3实验试剂
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1.2研究方法
本文采用的研究方法为液相色谱/大气压电离质谱法。目前实验常用方法为气相色谱质谱法，但该方法需要经过复杂的衍生化反映才能进行气相色谱分析。而样品衍生过程分为两个步骤：第一步将尿素转化为2-羟基嘧啶衍生物，第二步是利用甲基硅烷化作用。但该种方法有个弊端就是尿素衍生物在短时间内不稳定，易分解，可能导致色谱峰拖尾。也就是说该种方法样品前处理过于复杂及费时，故此次实验不采用此种方式。本次实验采用的液相色谱/大气压电离质谱法是基于Tetsuya Tamgawa，Yasuo Mlzo-oku，Kouichi Morlguchi，Takahiko Osumi和Masaaki Odomi建立的。该方法的特点在于直接使用高效液相色谱直接在尿素中定性定量分析，样品前处理简单，且检测结果准确和精密度皆在可接受范围以内。
1.3实验过程
1.3.1实验溶液配置及样品预处理
（一）标准溶液配置
尿素标准溶液配置：根据实验所需浓度计算所需尿素标志物质量及水溶液体积（在计算时需考虑标准物质纯度），精准称取实验所需质量精纯尿素标准物质融于标准体积水溶液，通过煮沸后冷却至室温完成配置过程。
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以上标准溶液配置完成以后分装，密封后置于实验用超低温空间中，-20℃的环境保存。
（二）校准比值混合溶液配置
据常规方法测定的血清样品中的大致浓度，用微量移液器将一定体积尿素标记物溶液取出，然后加入到一定体积的尿素标准溶液。使得校准比值溶液中尿素质量与标记物质量比分别为：0.8、0.9、1.1、1.2.配置好校准比值混合溶液后用进度为d=0.01mg的天平称量，并且记录读书，将室温下充分混匀，保持平衡。
（三）血清样品制备
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1.3.2数据处理
将样品制备好以后，就可以计算血清浓度了。本文采用的是括号法，括号法的数学模型为图1所示，计算公式为公式（1）
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图1 括号法
Figure 1 bracket method
1.3.3 实验环境
（一）沉淀剂用量
在确定样品之前，我们做了多组实验。分别往标记物标准溶液里面加入一定体积的乙腈，使得乙腈与标准溶液里面的血清体积比分别为2：1、3:1、4:1；观察里面的蛋白质沉淀情况。经过对混合溶液的观察分析，当乙腈与血清的体积比为3：1时，分层明显，上层溶液澄清，能够完全看清蛋白质沉淀。当体积比为2:1时，溶液呈现浑浊状态，当体积比为4：1时，沉淀效果变化不大，故最适合用于实验的乙腈与血清体积比例为3:1。
（二）色谱条件
色谱柱的选择：为了达到最好的实验结果，本次实验开始之前，对比了四种色谱柱，分别是：Agilent ZORBAX RX-SIL 4.6×150mm，5um；Agilent ZORBAX SB-Aq 2.1×150mm，3.5um；Dikma Inertsil ODS-SP2.1×150mm，5um；Venusil MPC-18 100A4.6×150mm，5um。通过实验对比发现，尿素在Agilent ZORBAX RX-SIL 4.6×150mm，5um上保留程度较大，故此次实验选择的是Agilent ZORBAX RX-SIL为分析柱。
流动相的选择：为了选择出最适合的流动相，本次实验对比了甲醇/水体系及乙腈/水体系。使用甲醇/水体系时，尿素在色谱柱上保留力度较小（Agilent ZORBAX RX-SIL 2.1×150mm，5um，有机相/水相=95/5，0.2mL/min，保留时间2.5min）；当使用乙腈/水体系时，尿素在色谱柱上保留力度较大，（Agilent ZORBAX RX-SIL2.1×150mm，5um，有机相/水相=95/5，0.2mL/min，保留时间6.8min）。
流动相比例的优化：为了得到最适合的流动相比例，本实验分别对比了乙腈/水体积=95/10、95/5、98/2时的状况，实验表明，当乙腈/水体积比为95/5时，尿素与基底物质中的其他物质能够很好的分离，且保留时间比较合适，峰形较好，用来作为流动相正合适。
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（三）质谱条件
为了得到最适合的质谱条件，在实验开始前，先对质谱进行一定分析。在全扫描（TIC）模式下，寻找分子离子峰。提取离子为尿素m/z61.1,内标m/z。在确定母离子后，选择反应监测（SIM）模式下优化Fragmentor参数，对比Fragmentor在60、80、100、120V时质谱信号的响应，发现在60V时，质谱响应最大，故确定60V为Fragmentor参数。
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在确定母离子和子离子以后，在多重反应监测（MRM）模式之下发生优化碰撞（Collision Energy，CE），不同CE下质谱响应为表1、表2，通过观察，在CE为20时，质谱响应最大，即将其确定为CE参数。
综合上述实验结果，本实验所用质谱条件为离子源：ESI（+）；数据采集时间为5min；扫描时间为200ms；MRM为m/z=61.1-44.0和64.1-46.0（尿素标记物）；干燥气温度为350℃；干燥气流速：9L/min；Nebulizer为40psi；Fragmentor为60V;CE为20V；Delta EMV为200V。
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1.4 分析过程
将四个调试好的校准比值混合溶液以从低到高的顺序进样，为了测量结果的准确，每个校准比值混合溶液需要重复测定三次。将尿素与尿素标记物的面积比值作为此次实验的评定标准。注意，如果所得结果的RSD超过了1%，就需要重新测定。如果尿素与尿素标记物质量笔峰面积比图像曲线的线性回归系数的平方小于0.999，也需要重新测定。
每个血清样品与它的一对标准同一批测定，在分析的时候，以高标、样品、低标、样品、高标、样品、低标次序进样。即每个样品都与其相邻的低标和高标对比校准，这样就能保证结果的RSD在1%以内。将实验所得结果均值作为此次实验的有效数据。
2结果与分析
2.1方法的精密度
为了监测此种方法的精密度，本文应用实验方法测定3种不同浓度的血清。将每种浓度、每个批次平均分为三次，进行平行测定。将结果进行统计分析，最后得出结论：该实验RSD值均小于1.0%，具有较好的精密度。
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2.2回收率
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2.3线性范围和监测限
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2.4 方法的验证
为了确定此方法的准确性，用该方法检测美国NIST血清标准物质SRM 909b水平I两次，且每次测试都需重复检测4次，测定的结果在标准范围以内，证实了该方法的准确度。
3定值结果
为了确定该方式在实际生活中的应用，用本文所建立的方式分别对两个水平的人血清中尿素标准物质进行定值。将结果统计如表5、表6所示。
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4结论
本文设立的利用LD-LCMS/MS测定人体血清中尿素含量的方法相对于传统ID_GC/MS法，前处理过程得到了较大简化。利用乙腈/水体系作为流动相，使得尿素在色谱柱上保留时间及保留力度都较强，且不需要缓冲盐，适用于质谱的分析。选择了同位素稀释质谱法能够保证该方法的高准确度与溯源性。在数据处理过程中，选用了括号法矫正质谱仪的波动，保证了数据的准确度。并且利用实验验证回收率及线性范围，将测定结果与国际标准不确定度对比，检测该方法的准确度。最后应用这个方式对两种浓度的血清标准物质进行检测，检测结果与标准结果只偏差0.32%和0.22%。综上分析，本文建立的血清尿素测定方式相对传统血清检测方式更为简单快速，且定量准确，有望成为检测血清中尿素的参考方法，并且为后续血清尿素标准物质的研究提供支持。
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个人简介: 武帅（出生年1987年） 女 汉 河北邢台
中国人民解放军总医院京北医疗区北清路门诊部
职称：初级 大学本科
主要研究方向或从事工作：临床医学检验。