1李文治 2谢瑾 3崔春
（1无限极（中国）有限公司 广东广州 510600)
(23华南理工大学食品科学与工程学院 广东广州 510640）
摘要：水苏糖是天然存在的非还原性功能性低聚糖，具有增殖肠道益生菌、抑制腐败菌生长，促进肠道蠕动等活性。本文以草石蚕提取液为原料，探讨了解淀粉芽孢杆菌发酵时间对草石蚕提取液中水苏糖、蔗糖、棉子糖、果糖和葡萄糖等含量的影响。采用解淀粉芽孢杆菌在30℃发酵草石蚕提取液48h，提取液中蔗糖的保留率仅33.3%，水苏糖保留率为95.5%，棉子糖保留率为71.4%，葡萄糖保留率为84.0%，蔗糖含量略有增加。草石蚕提取物样品经过进一步纯化后，水苏糖含量达到87.8%。
关键词：水苏糖 解淀粉芽孢杆菌 发酵
水苏糖是唇形科水苏属植物中天然存在的非还原性功能性低聚糖，具有增殖肠道益生菌、抑制腐败菌生长，促进肠道蠕动等活性，是一种新型功能性食品配料，具有广阔的应用前景和巨大的开发价值[1,2]。但从天然原料如宝塔菜中直接提取的水苏糖产品纯度较低，果糖、蔗糖和棉子糖等“杂糖”的存在降低了产品中水苏糖的含量。国内关于制备高纯度水苏糖的工艺研究不多，但主要是利用微生物发酵法、膜分离法或工业色谱分离法制备，但膜分离法或工业色谱分离法对设备要求高且需要较高成本。课题组前期建立了高效液相色谱法(HPLC-ELSD) 测定草石蚕中低聚糖含量的方法[2]，探讨了黑曲霉, 米曲霉, 干酪乳杆菌, 瑞士乳杆菌, 鼠李糖乳杆菌对草石蚕提取液中水苏糖保留率和蔗糖降解率的影响, 筛选出最佳单菌发酵菌株，并利用黑曲霉和乳杆菌混菌发酵36h，活性肽脱色和超滤膜过滤后，水苏糖含量高达78.13%[3,4]。但如何进一步提高水苏糖含量仍有待进一步研究。
有鉴于此，本文在前期研究的基础上，以草石蚕提取液为原料，探讨了解淀粉芽孢杆菌发酵时间对草石蚕提取液中水苏糖、蔗糖、棉子糖、果糖和葡萄糖等含量的影响，以期进一步提高水苏糖纯度。本研究可为微生物发酵法纯化水苏糖提供理论和方法指导。
1实验材料与方法
1.1实验材料
干基草石蚕：采购于甘肃镇原，清洗晒干后贮藏于干燥器中备用；解淀粉芽孢杆菌SWJS22：从中国南海海泥中筛选出的产碱性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，于2013年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center），保藏编号为CGMCC No. 8425。水苏糖标品（≥98.0％）：购自美国Sigma公司；棉籽糖（≥98.0％）：购自阿拉丁试剂公司；甘露三糖、蔗糖、葡萄糖、果糖：购自上海博奥生物技术有限公司；其他试剂：均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Waters系列高效液相色谱仪 2414-示差检测器美国Waters公司；Agilent-Zorbax NH2柱（4.6ｍｍ×
250ｍｍ，5μｍ） 美国安捷伦科技有限公司；电子天平 AL204分析天平梅特勒－托利多仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SCIENTZ-18N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；GL-21M 高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。
1.3实验方法
1.3.1 草石蚕发酵工艺流程
取50g干燥的草石蚕放入锥形瓶中, 加入450g去离子水, 在常温下分别静置30min后，在102℃下提取80 min后，取0.1mL活化的菌液于100mL灭菌过的草石蚕提取液中，30℃下间歇震荡培养，分别于12, 24, 36, 48h取样, 在95℃沸水浴中加热15min灭菌，活性碳脱色、超滤膜过滤，冷冻干燥得水苏糖样品。
1.3.2水苏糖含量的测定方法
水苏糖含量的测定:采用高效液相色谱法, 参照GB/T 22221—2008《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定高效液相色谱法》, 略作修改。
2实验结果
2.1发酵时间对发酵液产物中水苏糖含量的影响
解淀粉芽孢杆菌是本实验室从中国南海海泥中筛选出的高产碱性蛋白酶的微生物。近期研究发现，该菌株对葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖均有较好的同化效率，其原因可能是该菌株能分泌多种胞外酶，如α-淀粉酶、蔗糖酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶等。在草石蚕粗提液中，除水苏糖外，蔗糖和棉子糖含量最高，约占总糖的11%，是影响水苏糖纯度的主要杂糖。
解淀粉芽孢杆菌分泌的这些碳水化合物水解酶的对发酵液中各糖的分解利用以及各酶之间的相互作用，会影响最终发酵液中各糖的含量。解淀粉芽孢杆菌发酵过程中，各糖的含量变化结果见图1和图2。
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图1解淀粉芽孢杆菌发酵草石蚕提取液过程中水苏糖和蔗糖含量的变化
由图1可知，解淀粉芽孢杆菌发酵草石蚕提取液时，发酵液中蔗糖发生快速降解，发酵48h后其含量从7.2g/L降低到2.4g/L，保留率仅33.3%。与之对应，水苏糖含量从28.9g/L降低到27.6g/L，保留率为95.5%。
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图2解淀粉芽孢杆菌发酵草石蚕过程中棉子糖、果糖和葡萄糖含量的变化
在解淀粉芽孢杆菌发酵草石蚕提取液过程中，发酵48h后棉子糖含量从3.5g/L逐渐下降到2.5g/L，保留率为71.4%。果糖含量的变化规律与棉子糖有所区别，发酵12h后，发酵液中果糖含量从1.5g/L增加至2.4g/L，随后进一步下降到1.7g/L。其原因可能是蔗糖降解产物为葡萄糖和果糖，当蔗糖的降解速度大于解淀粉芽孢杆菌消化吸收速度时，发酵液中果糖含量呈上升趋势。在整个发酵过程中，发酵液中葡萄糖含量从1.9g/L下降到1.6g/L，保留率为84.0%。
对发酵产物进行灭菌、活性炭脱色、超滤膜过滤、浓缩和喷雾干燥后，得到草石蚕提取物样品。经过HPLC测定后，草石蚕提取物样品中水苏糖含量达到87.8%。
3结论
采用解淀粉芽孢杆菌在30℃发酵草石蚕提取液48h，提取液中蔗糖的保留率仅33.3%，水苏糖保留率为95.5%，棉子糖保留率为71.4%，葡萄糖保留率为84.0%，蔗糖含量略有增加。草石蚕提取物样品经过进一步纯化后，水苏糖含量达到87.8%。
参考文献：
[1]黄伟志, 钟先锋, 彭家伟, 等. 水苏糖生产, 功能及其应用简述[J]. 食品工业科技, 2018, 39(1): 327-332.
[2]韩诗雯, 高加涛, 桑若杰, 等. 水苏糖调节肠道功能及作用机制研究[J]. 食品科技, 2019 (4): 59.
[3]王智荣, 崔春, 赵谋明. HPLC—ELSD 测定草石蚕低聚糖含量的研究[J]. 中国调味品, 2017, 42(6): 114-117.
[4]舒丹阳, 谢瑾, 崔春. 微生物发酵法制备高纯度水苏糖的研究[J]. 中国调味品, 2019, 44(5): 1-4.
[5]周文斯, 熊犍, 谢瑾, 等. 发酵法提纯草石蚕中水苏糖的工艺研究[J]. 中国调味品, 2018 (7): 5.
[6] 汤文浩, 江胜.产甘露聚糖酶解淀粉芽孢杆菌的筛选鉴定及产酶条件优化[J].湖北农业科 学,2013,52(7): 3015-3018.