摘要：将罗非鱼的鱼皮作为原料，采用酶法来制备胶原蛋白肽制品。对此需要对罗非鱼皮的基本组成成分进行测定，并采用低温连续变相萃取技术来对鱼皮进行脱脂处理，将水解度、水解产物分子量和感官评定作为具体指标，探讨了蛋白酶种类对酶解所产生的影响。首先，以水解度为指标，探讨了酶解条件对水解度所产生的影响，并采用了响应面试验来优化鱼皮胶原蛋白肽制备工艺。其次，用凝胶过滤色谱法来对酶解液分子质量分布进行测定，其结果表明，在采用碱性蛋白质对鱼皮进行水解时可以取得最好的效果。
关键词：罗非鱼皮；胶原蛋白肽；工艺优化
现如今，胶原蛋白及活性肽在生物、医疗、化妆品、食品、饲料等诸多领域当中均得到了广泛的应用。而胶原蛋白肽由于其所具有的弱抗原性和低过敏性等特点，再加上易水解、原料廉价和具有良好的生物相容性等优势，因此可以在许多行业当中进行使用。水产胶原蛋白活性肽能够对胃黏膜起到保护作用，而且还具有抗氧化、过敏、衰老以及溃疡等功能，能够降血压、胆固醇，并有效的预防骨质疏松和关节炎等相关生理功能。而且其相对分子质量相对较低，因此容易被肠道吸收，在进入患者体内后，其生理功能不容易遭到破坏。罗非鱼是我国养殖量排于第二位的一种鱼种，年产量可以达到180多万吨。现如今，罗非鱼的主要生产、加工均以出口冷冻鱼肉片为主，而在实际加工过程当中所产生的下脚料大约占鱼全身重量的60%-70%，具体部位包括鱼皮、鱼头以及鱼骨等，在这些副产物当中有着十分丰富的蛋白质，尤其鱼皮当中所含有的胶原蛋白十分丰富。但鱼皮多数副产物往往被作为饲料鱼粉的原料或者废料进行丢弃，这不仅污染了我们的环境，而且也造成了严重的资源浪费。通过对这些鱼皮进行有效的利用，不仅能够提升经济效益，而且还能够减少环境污染。目前水产胶原的研究和应用正逐渐被相关科研工作者加大重视，而罗非鱼皮当中所具有的丰富营养也使其成为了一种新的胶原蛋白肽来源，从罗非鱼皮当中进行胶原蛋白肽的提取已成为当今的一项研究热点[1]。
一、材料与方法
酶水解法和热水抽提法以及酸水解法等相比，能够在特定条件下进行定位水解分裂，从而产生具体的肽，而且不会破坏氨基酸，其构型也不会产生相应的变化。本文当中，主要将沿海地区淡水养殖的罗非鱼皮进行加工，将鱼皮作为原料，并以水解产物分子量、水解度以及感官评价等作为具体的指标，采用碱性蛋白酶水解法，运用单因素实验和响应面实验来对罗非鱼皮胶原蛋白肽的制备工艺进行优化和创新。
（一）材料与试剂
罗非鱼皮主要来源于广东省某水产品有限公司，在本次实验当中所使用的碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及中性蛋白酶等均来自于广西南宁某生物工程有限公司。
（二）仪器设备
在本次实验当中所采用的仪器包括低温连续相变萃取装置、PH剂、电热恒温数显水浴锅、水浴恒温振荡器、紫外可见分光光度计以及高效液相色谱仪等。
（三）试验方法
1.酶解工艺
将一定量脱脂的干制罗非鱼皮进行称取，在常温条件下添加三级水进行浸泡，时间为两个小时。之后使用蒸馏水来对样品进行清洗和过滤，重复三次后将其置于三角瓶当中。之后需要按照料液比为1:15加入三级水，料液在进行酶解前首先需要经过热处理，温度条件为85摄氏度，处理时间为20分钟。当其冷却为室温后，需要在各酶的最适温度下进行预热，时间为10分钟，并使用一定浓度的盐酸溶液或氢氧化钠溶液来对酶的PH值进行调节。之后需要加入一定量的蛋白酶，使水解反应启动，并在酶的最适温度下进行酶解。当酶解反应一段时间后，需要从恒温摇床当中取出水解混合物，并将其温度升高到95℃，然后持续加热，时间为20分钟，使酶失活。待冷却室温后，需要进行离心处理，并将上清液进行收集，使用水进行定容[2]。
2.酶解单因素实验
加酶量会对酶解反应产生一定的影响，首先固定料液比为1:15，温度为50摄氏度，PH值则调为8.0，酶解时间设计为6个小时，探讨不同加酶量对水解度所产生的影响。之后需要分析PH对酶解反应所产生的影响，温度条件仍然为50摄氏度，料液比为1:15，加酶量则为5%，酶解时间设计为6个小时，对不同PH值下水解度所产生的影响进行考察。之后是探讨温度对酶解反应所产生的影响，PH值取为8.0，加酶量为5%，料液比仍为1:15，酶解时间设计为6个小时，对不同温度下酶解水解度所产生的影响进行考察。最后，则是需要探讨时间对酶解反应所产生的影响。而单因素实验过程当中，加酶量需要分别取1%-10%，PH值则取7.0-11.0，酶解温度则取45-65摄氏度，时间则取1-10小时。
3.响应面优化设计
相关实验人员应在单因素试验的基础上来有效的设计响应面实验，针对加酶量、PH值、温度以及时间这四个因素来合理的优化提取工艺。
4.分析测定方法
在对罗非鱼鱼皮的基本组分进行测定时，首先其水分应该按照食品中水分的测定方法来进行测定，而灰分则需要根据食品中灰分的测定方法来进行测定。蛋白根据食品中蛋白质的测定方法来进行测定，而在对水解度进行测定时，则主要采用OPA法。对样品分子量分布的测定，则主要采用高效液相色谱仪进行测定，同时还需要使用相关软件来进行分析。最后在对胶原蛋白肽粉的感官进行评定时，主要参考相关文献，挑选十名具有良好感官机能的检查人员，针对胶原蛋白肽粉的色泽、腥味以及滋味等进行具体的感官评价，并对其评价分数等进行统计和分析，当其分值越小时，则说明其测定结果越好[3]。
二、结果
（一）罗非鱼鱼皮主要成分分析
将罗非鱼鱼皮原料在冷冻条件下运送到实验室后，需要先使用自来水进行清洗，并在室外进行晾晒，接着进行低温干燥处理、粉碎后然后进行备用，其化学组成具体包括水分、蛋白质、脂肪和灰分。而通过具体的测定后发现其鱼皮水分含量为10.25%，蛋白质含量为76.98%，灰分含量为1.22%，脂肪含量为9.50%。
（二）水解蛋白酶的选择
在本次实验当中，主要选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶等，根据各蛋白酶的最适作用温度和PH值来进行具体的酶解，而不同蛋白酶对罗非鱼皮的胶原蛋白水解度以及分子量等相关指标所产生的影响存在着一定的差异。通过其结果能够看出，不同蛋白酶在酶解鱼皮后，其水解度、分子量分布以及感官评价等均有着显著性的差异，P＜0.05，具有统计学意义。而在本次试验所使用的水解蛋白酶当中，风味蛋白酶所具有的分解度最高，为27.07%。而胃蛋白酶的水解度最低，为1.40%。
（三）酶解最佳条件
酶解的最佳工艺条件为加酶量7%，时间7个小时，温度条件为60摄氏度，PH值应在10.38。在这一条件下，碱性蛋白酶可对罗非鱼皮进行水解，而且水解度最高可以达到23.01%[4]。
结束语：
综上所述，在本次实验当中，以罗非鱼鱼皮作为原料，研究利用酶法制备胶原蛋白肽制品，对鱼皮的基本组成成分进行了测定，并采用相关技术对鱼皮进行了脱脂处理，以分子量分布、水解度、感官评价等作为具体指标，从各碱性蛋白酶当中筛选出最为适合的水解酶。同时，通过单因素实验和响应面实验来有效的优化酶解的工艺条件，最终得到鱼皮胶原的肽制备工艺的相关工艺条件为时间7小时，加酶量为7%，温度条件为60℃，PH值为10.38，在这一状态下，碱性蛋白酶对罗非鱼皮进行水解可以达到最高的水解度，具体值为23.01%。
参考文献：
[1]李敏雄,郭斌,刘飞,曹庸.罗非鱼皮胶原蛋白肽制备的工艺优化[J].现代食品科技,2018,34(07):205-212.
[2]刘蒙蒙. 罗非鱼皮胶原蛋白肽—葡萄糖在不同体系中美拉德反应的研究[D].昆明理工大学,2016.
[3]段秀. 罗非鱼皮胶原蛋白肽亚铁螯合修饰及生物活性研究[D].昆明理工大学,2016.
[4]刘永,叶娴,韦寿莲.罗非鱼鳞胶原蛋白肽铁螯合物制备工艺的优化[J].精细化工,2016,30(07):761-765.