摘 要：本文在GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》的基础上结合铜绿假单胞菌的生物学特性对其检测方法进行详细分析和研究，使该检测方法能被更好地应用。
关键词：铜绿假单胞菌；饮用天然矿泉水；检验方法；生物学特性
1 概述
绿脓杆菌，又称铜绿假单胞菌，1882年首先由Gersard从伤口脓液中分离得到，是一种革兰氏阴性菌、好氧、呈长棒形的细菌，只有单向运动性。感染后因脓汁和渗出液等病料呈绿色，因此得名绿脓杆菌，其在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。是一种常见的条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。菌体细长且长短不一，铜绿假单胞菌有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显微镜或相差显微镜下可观察到细菌运动。铜绿假单胞菌可产生多种色素，如绿脓素与带荧光的水溶性荧光素。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有绿脓杆菌的存在。绿脓杆菌喜潮湿环境、为专性需氧菌，生长温度范围25~42 ℃，最适生长温度为25~30 ℃，具有在4 ℃不生长而在42 ℃可以生长的特点。每年的春季、夏季和秋季都适合此菌的生长。因此，桶装水中铜绿假单胞菌的检测逐日被重视。
2 检测方法
桶装水中铜绿假单胞菌的检测采用GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》【1】中的滤膜法。
2.1 滤膜
采用孔径为0.45 μm的一次性灭菌滤膜。
2.2 取样
对于目标菌量少的样品，一般取样250 mL；但对于目标菌量大的样品，可以采取取25 mL水样加入225 mL生理盐水中进行10倍稀释。
2.3 过滤口的消毒灭菌与过滤杯的选择
可采用火焰枪灭菌，也可采用烧灼棉球过火法。一般采用棉球较为方便；火焰枪需及时更换乙炔气瓶，且气瓶需配套使用。随着科学的进步和仪器技术的提升，现可采用承托一次性有底座滤杯的泵头，可批量进行过滤，而无需每次对泵头进行消毒灭菌。样本量大的实验室可选用一次性过滤杯，虽方便快速，但成本高；样本量小的实验室可选用不锈钢的过滤杯，但要做好消毒灭菌工作，以防交叉污染。
2.4 滤膜的放置
用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，放在已灭菌的滤床上，抽滤后将与水接触的面朝上（为使细菌均匀分布在滤膜上；若与水接触面朝下，则细菌会成簇或成团生长，无法计数并鉴定），固定过滤后贴于CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间留有气泡（目的是使菌落能近距离接触琼脂的营养）。
2.5 过滤
需在100级的超净工作台进行过滤。铜绿假单胞菌广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，在洁净度级别高于100级的环境中过滤，检验人员做好试验前消毒防护准备，就能有效控制外来带入的细菌污染。
2.6 培养
标准培养时间为24～48 h。因CN琼脂成分中有明胶，根据铜绿假单胞菌会液化明胶的生化特性，若有可疑菌的出现，应及时将目标菌再次纯化（在CN琼脂上挑取单个菌落划线接种营养琼脂或血平板于36 ℃±1 ℃培养20～24 h）。
2.7 可疑菌的选择
利用铜绿假单胞菌在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等特性。本标准使用的是假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂，铜绿假单胞菌多数会产生绿脓素使培养基变绿，菌落呈蓝绿色，在紫外光照射下产荧光（注意不能在紫外光下照射过长时间）；很少出现红褐色和只产荧光非蓝/绿色菌落。尽可能将所有经滤膜过滤后的可疑菌落纯化（见上文2.6培养）。
2.8 镜检形态
铜绿假单胞菌为革兰阴性菌，革兰染色后高倍显微镜下为菌体呈粉红色，菌体大小（1.5～5.0）μm×宽（0.5～1）μm，细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，无芽胞。
【2】
2.9 其他培养基上的形态
为验证可疑菌为铜绿假单胞菌，通常挑取可疑菌接种至普通琼脂培养基、血平板和麦康凯琼脂培养基中观察其形态。以下是铜绿假单胞菌在这些培养基上的标准形态。
2.9.1 普通琼脂平板培养基（营养琼脂平板）
经18～24 h培养可形成圆形、大小不一、边缘不整齐、扁平、隆起、光滑、湿润、且呈融合状态的菌落。【2】
2.9.2 血平板
经18～24 h培养，可形成扁平、湿润、有光泽，有特殊气味（生姜味）的灰绿色或蓝绿色菌落，菌落周围有透明溶血环。【2】
2.9.3 麦康凯琼脂培养基
经18～24 h培养可形成微小无光泽半透明菌落，48 h后菌落中心常呈棕绿色。【2】
2.10 生化试验及生化特性
若有可疑菌，则通过氧化酶鉴定、色素鉴定及产氨试验来确证是否为铜绿假单胞菌；且应以铜绿假单胞菌标准菌株作为阳性对照菌和荧光假单胞菌标准菌株作为阴性对照菌。阳性菌和阴性菌的对照主要区别在色素的鉴定和产氨试验中。
2.10.1 氧化酶鉴定
铜绿假单胞菌（阳性菌）和荧光假单胞菌（阴性菌）氧化酶试验均为阳性。
2.10.2 色素鉴定
可将目标菌接种于King A、B斜面培养基，37 ℃培养24 h或置室温观察5 d。
（1）绿脓色素。在King A斜面上呈深绿色，液体培养基接触空气处绿色明显。若色素不明显或混杂其他色素，可加氯仿（三氯甲烷）于斜面，置室温观察1～24 h，如仍不明显，可在氯仿液中滴加1 mL稀盐酸（1 mol·L-1），绿脓色素在酸液层呈红色。
（2）绿脓荧光色素。铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌在King B斜面培养基上均呈现黄绿色荧光。
（3）红脓色素。在King A斜面培养基上呈红紫色，如置37 ℃培养24 h红色不明显，可放置室温3～5 d观察。铜绿假单胞菌产生红脓毒素者较少见。
铜绿假单胞菌（阳性菌）产绿脓色素、红脓色素、青脓色素、荧光素，荧光假单胞菌（阴性菌）产荧光素。绿脓色素在铜绿假单胞菌的致病中起重要作用，能催化超氧化物和过氧化氢产生有毒基团，引起人体组织的损伤。【2】
2.10.3 产氨试验
铜绿假单胞菌（阳性菌）有大多数都会呈阳性，荧光假单胞菌（阴性菌）大多数都会呈阴性。因此CN琼脂上生长的菌落呈蓝/绿色的且紫外灯照射下产黄绿色荧光的不需要进一步生化确证试验；只产荧光而非蓝/绿色的菌落需要做产氨试验；红褐色菌落的需要做产氨试验、氧化酶试验和金氏B培养基上的产荧光试验。
2.11 计数与结果报告
可疑菌通过生化确证试验后，根据公式（1）计算铜绿假单胞菌的菌落数
N=P+F(cF/nF)+R(cR/nR) （1）
式（1）中，N为250 mL水样中铜绿假单胞菌的菌落数，单位为CFU/250 mL；若水样取25 mL，则报告铜绿假单胞菌的菌落数为N×10，单位不变；10倍系列稀释的以取水样为25 mL的类推。
3 结论
通过标准GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》中的铜绿假单胞菌检测方法结合铜绿假单胞菌的生物学特性，从多方面理解和分析铜绿假单胞菌的检测方法，有利于提升检测水平。
参考文献：
[1]国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局.GB 8538-2016 食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法[S].北京：中国标准出版社，2016.
[2]倪语星，尚 红.临床微生物学与检验[M].北京：人民卫生出版社，2007.