【摘要】目的：本文主要分析毛囊角化病患者体内ATP2A2基因突变的结果。方法：选择2017年10月-2019年12月由于毛囊角化病进入我院接受治疗的患者以及对应的健康人群抽取的外周血DNA作为本次临床研究的样本，使用聚合酶链反应对血液中的ATP2A2基因全部外显子进行扩增，并对进行DNA测序工作。结果：本次实验分析结果显示，收集到的临床标本中包含2个系谱以及3个散发的患者，且一共存在3个ATP2A2基因突变的患者，其中包括1例患者存在ATP2A2基因缺失突变情况，1例患者存在ATP2A2基因插入突变情况以及1例ATP2A2基因错义突变，这几个基因突变都是当前报道不多的基因突变情况。并且，本次实验研究的健康组人员并未发现上述基因突变。结论：本次实验研究收集的毛囊角化症患者均存在不同的ATP2A2基因突变，这些基因突变的症状都会对患者角质形成细胞中钙离子的转运产生部分影响，致使患者的表皮细胞连接以及分化出现不同程度的异常变化。
关键词：毛囊角化病；ATP2A2；基因突变；结果
毛囊角化症又被称作为Darier（DD）疾病，该病属于一种比较少见的皮肤细胞角化不良作为主要病变的丘疹鳞屑性皮肤疾病[1]。毛囊角化及病属于常染色体显性遗传疾病，患有该病的患者临床症状主要表现为在身体脂溢性区域可以发现坚硬的毛囊性丘疹，且这些丘疹常呈现为对称分布的症状，部分丘疹表面可能附有油腻性的连续，甚至伴随恶臭以及瘙痒等[2]。人群患有毛囊角化病的发病几率大约为1/55000－1/100000左右，则常以青春期的人群为主，而日晒以及潮湿的环境可以加重患者的病情[3]。毛囊角化症的组织学特点为人体皮肤棘层以及饺子城中出现角化不良的细胞，该细胞形成谷粒或者圆体，且人体皮肤的棘层逐渐松解形成裂隙，当人体皮肤角化过度后，毛囊角栓[4]。上世纪国外学者表明，人体发生毛囊角化症主要是由于ATP2A2基因突变所致[5]。基于此，本文选择2017年10月-2019年12月由于毛囊角化病进入我院接受治疗的患者以及对应的健康人群抽取的外周血DNA作为本次临床研究的样本，使用聚合酶链反应对血液中的ATP2A2基因全部外显子进行扩增，并对进行DNA测序工作，最终分析毛囊角化症和ATP2A2基因突变之间的联系，现报告如下。
1 资料与方法
1.1一般资料
选择2017年10月-2019年12月由于毛囊角化病进入我院接受治疗的患者以及对应的健康人群抽取的外周血DNA作为本次临床研究的样本。家系1，一共三代人，家族中发现四人患病，先证者为30岁左右的男性，该男性在两年前面颈部逐渐出现褐色角化性的丘疹，皮肤损害逐渐扩散至躯干、腋窝以及腹股沟。系谱中其他患者仅为轻度的病变累及，疾病主要的症状表现为面部存在散在的皮质角化性丘疹。家系2，一共两代人，四人发病，先证者为46岁的男性，该患者在14岁时在前胸部位以及颈部出现浅棕色的角化性丘疹，并逐渐蔓延到躯干、上肢、股部以及拓部，最终病变的皮疹融合成片，在患者的下腹部以及胫前可以发现糜烂以及渗出症状。患者经过日晒或者出汗时，病情逐渐加重。患者常会感到疲乏无力的情况，目前已丧失劳动能力。患者的弟弟40岁和先证者的临床症状基本相似。散发的病例1为37岁的男性，该患者七岁发病，头面部以及躯干可以看见疣状角化性丘疹，并伴有恶臭。散发病例2为24岁男性，该患者20岁发病在颈部以及前胸部位，可以看见散在分布的角化性丘疹。散发病例3为22岁的女性，该患者在22岁发病，出现角化性丘疹的部位为颈部、胸前。这五例患者的临床病理检验结果都显示为:患者的表皮角化过度并伴角化不全，棘层增厚，棘层松懈形成腔隙，可以看见绒毛、谷粒细胞以及圆体细胞。患者的真皮浅层存在炎性浸润，最终都诊断为毛囊角化病。
1.2方法
1.2.1抽取外周血提取DNA
本次临床实验研究获得患者以及患者家属的知情同意，并签署知情同意书。采集参与本次实验的患者以及家系中正常人体外周血液各5毫升，同时采集同等数量与患者并不存在任何亲缘关系的正常人群外周血液各5ml。提取两组人群的基因组DNA进行对比并排除基因多态性。本次实验研究的血液样本都经过2%的EDTA抗凝处理。保存在零下80℃的环境中。使用DNA提取试验和提取血液样本中的基因组DNA。
1.2.2ATP2A2基因外全部外显子的扩增
根据参考文献中设计的特异性引物18对，扩增包括21个外显子以及和内含子交界区域的序列。
本次实验研究中外显子8引物序列为：上游5’-GTTGTATGGCTGGTTGCTTG-3’，下游为5’-GAA-CAAAGAACCACGACACG-3’；外显子为12+13引物序列：上游5’-ATTGCCACCCAGTAGTATCC-3’，下游5’-GAACTGTTTGACCTTTTGCTTG-3’；外显子19+20引物序列为：上游5’-TCCCCACCTCTCCTTGCTC-3’，下游5’CCTCCATCACCAGCCAGTAT-3’。扩增的条件为：8好外显子在94℃的环境下变性30秒，57℃环境下复性30秒，72℃环境下延伸1分钟。12+13号外显子在95℃环境下变性30秒，55℃环境下复性30秒，72℃环境下延伸1分钟。19+20号外显子在95℃环境下变性30秒，59℃环境下复性30秒，72℃环境下延伸1分钟。一共进行35个循环，总反应体系为50μL。1.5%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，PCR产物的纯化以及测序则由相关部门或者公司负责完成。
2 结果
最终在实验研究的PCR产物进行DNA直接的测序发现，两个系谱以及一例散发的病例中存在ATP2A2基因三个突变情况。家系1病例的13号外显子中存在4个显著的碱基缺失ATP2A2基因突变。家系2病例患者在20号内含子部位存在5个碱基插入ATP2A2基因突变。散发性病例1发现其第8外显子中存在一个ATP2A2基因错义突变，散发病例2中并没有发现ATP2A2基因突变的情况。
参与本次临床实验研究的健康人员血液标本DNA中并未没有发现上述的ATP2A2基因突变情况。
3 讨论
上世纪国外的学者通过研究发现，位于12q23-q24.1区域内的编码肌浆/内质网钙离子-ATP酶中的ATP2A2基因是导致人体发生毛囊角化症的主要致病基因[6]。ATP2A2基因的长度大约为76kb，其是由21个外显子共同组合而成。SERCA2则是由β链区、磷酸化区以及ATP结合区胞浆面的三个单位以及跨膜区域内的跨膜蛋白共同组合而成，同时铰链区内的ATP结合区和跨膜蛋白连接，最终构成一个完整的功能单位[7]。SERCA2中通过将钙离子从细胞浆中转运到内质网腔中，并对人体皮肤的表皮细胞连接以及分化产生重要的作用，而根据其所具有的羟基端存在的差异，SERCA2可以分成SERCA2a和SERCA2b两个不同的类型[8]。国内外报道的ATP2A2基因突变种类中大约包含170多种，且这些ATP2A2基因基因突变的位点分散于整个ATP2A2基因内，并没有发现其所为的突变热区。而对于基因型的毛囊角化症和表型毛囊角化症之间是否存在部分关系，依旧还不够明确。而本次临床观察到的2例散发毛囊角化症患者中，并没有对其检测出ATP2A2基因突变情况。出现这一情况的因素可能是由于患者的ATP2A2基因突变发生在内含子或者外显子和内含子连接之外的区域内，另一方面则可能是由于受到其他的因素影响，致使ATP2A2基因表达出现了钙离子-ATP酶功能的缺陷情况。
本次实验分析结果显示，收集到的临床标本中包含2个系谱以及3个散发的患者，且一共存在3个ATP2A2基因突变的患者，其中包括1例患者存在ATP2A2基因缺失突变情况，1例患者存在ATP2A2基因插入突变情况以及1例ATP2A2基因错义突变，这几个基因突变都是当前报道不多的基因突变情况。并且，本次实验研究的健康组人员并未发现上述基因突变。
综上所述，本次实验研究收集的毛囊角化症患者均存在不同的ATP2A2基因突变，这些基因突变的症状都会对患者角质形成细胞中钙离子的转运产生部分影响，致使患者的表皮细胞连接以及分化出现不同程度的异常变化。
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[通讯作者]E-mail:duanyan516@sohu.com