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PIP5K1C在尼古丁戒断致痛觉过敏形成中的作用

发表时间：2020/1/2 来源：《医师在线》2019年10月20期作者：秦静李兴达翁洪亮邱彦明李秀峰

[导读] 探讨PIP5K1C在尼古丁戒断致痛觉过敏形成中的作用。

　　　　      秦静李兴达翁洪亮邱彦明李秀峰
　　         （临沂市中心医院；山东临沂276400）
　　【摘要】目的：探讨PIP5K1C在尼古丁戒断致痛觉过敏形成中的作用。方法：健康雄性SD大鼠60只，按数字表法随机分为正常对照组、NS组、UNC3230组、MK-2206组，每组15只，除正常对照组外，均建立鞘内置管及尼古丁依赖/戒断模型，观察大鼠TWL、MWT，并按设计给药，观察1~7dTWL、MWT变化，Western blot法检测大鼠脊髓PIP5K1c、PIP2、Akt在DRG神经元中的蛋白表达水平。结果：与正常对照组对比，其它各组大鼠在尼古丁戒断后1~7dTWL、MWT值均明显降低，且在5d时降为最低，差异有统计学意义（P<0.05）；鞘内给药后，与NS组相比，UNC3230组、MK-2206组TWL、MWT值明显升高（P<0.05）；与正常对照组相比，NS组大鼠DRG神经元中PIP5K1c、PIP2、Akt蛋白表达明显升高（P<0.05）；与NS组相比，UNC3230组、MK-2206组PIP5K1c、PIP2、Akt蛋白表达明显降低（P<0.05）。结论：PIP5K1c可通过抑制PIP2-Akt信号通路调控尼古丁戒断大鼠模型的痛觉过敏形成。
　　【关键词】磷脂酰肌醇-4-磷酸盐5-激酶型1C；磷脂酰肌醇4，5二磷酸；尼古丁戒断；痛觉过敏
　　The role of PIP5K1C in the formation of hyperalgesia induced by nicotine withdrawal
　　         QIN Jing Li Xing-da Weng Hong-liang QIU Yan-ming LI Xiu-feng
　　 Linyi Central Hospital,Shandong Linyi, 276400
　　【Abstract】Objective：To explore the role of PIP5K1C in the formation of hyperalgesia induced by nicotine withdrawal.Methods:Sixty healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group, NS group, UNC3230 group and MK-2206 group, with 15 rats in each group. In addition to the normal control group, the sheath tube and nicotine dependence were established. The withdrawal model was used to observe TWL and MWT in rats. The rats were administered according to the design. The changes of TWL and MWT were observed by 1~7d. The protein expression levels of PIP5K1c, PIP2 and Akt in DRG neurons were detected by Western blot.Result:Compared with the normal control group, the TWL and MWT values of the other groups were significantly decreased at 1-7 days after nicotine withdrawal, and decreased to the lowest at 5 days (P<0.05). After intrathecal administration Compared with the NS group, the TWL and MWT values of the UNC3230 group and the MK-2206 group were significantly increased (P<0.05). Compared with the normal control group, the expression of PIP5K1c, PIP2 and Akt protein in the DRG neurons of the NS group was significantly higher than that of the normal control group. The expression of PIP5K1c, PIP2 and Akt protein in UNC3230 group and MK-2206 group was significantly lower than that in NS group (P<0.05).Conclusion: PIP5K1c regulates hyperalgesia in a rat model of nicotine withdrawal by inhibiting the PIP2-Akt signaling pathway.
　　【Key words】Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase type 1C;Phosphatidylinositol 4,5 diphosphate;Nicotine withdrawal;Hyperalgesia
　　    烟草危害是当今世界最严重的健康问题之一，有关文献显示，全球每年接受手术治疗的成年人中约30%正处于烟草危害阶段，数百万患者围术期出现与之相关的严重并发症[1]。长期吸烟可引起尼古丁依赖，戒烟后会产生尼古丁戒断症状[2]。近期研究发现尼古丁依赖/戒断患者术后痛觉敏感性及阿片类药物用量明显增高，可能与脊髓神经元对疼痛信息传递的兴奋性调控有关[3]，但其具体机制尚不明确。相关文献显示，磷脂酰肌醇4，5二磷酸（PIP2）属膜磷脂类，可通过调控胞膜多种通道蛋白参与疼痛外周敏化的形成[4]。背根神经节（DRG）神经元在急慢性动物模型痛觉过敏形成中发挥重要作用，近期研究发现磷脂酰肌醇-4-磷酸盐5-激酶型1C（PIP5K1C）是调控DRG细胞部位PIP2合成的主要激酶[5-6]。因此，本研究通过分析PIP5K1C在尼古丁戒断大鼠模型痛觉过敏形成中的作用，为该类患者的靶点治疗提供依据。
　　1.材料与方法
　　1.1材料清洁级健康雄性SD大鼠，体重180~250g，购于南京君科生物工程有限公司。在室温（24±2）℃、湿度50%条件下饲养，自由摄食饮水。
　　1.2实验方法
　　1.2.1尼古丁依赖/戒断大鼠模型的建立大鼠每日注射尼古丁6次，剂量从0.5mg/Kg逐渐递增至4mg/Kg，共给药9d。末次给药后60min注射 1mg/Kg美加明。
　　1.2.2鞘内置管大鼠的建立尼古丁依赖/戒断大鼠建立成功后，经大鼠枕骨大孔行鞘内置管，次日未见神经功能异常后，鞘内注射2%利多卡因20L，如出现后置麻痹，则提示置管成功。
　　1.2.3动物分组取以上制备成功的大鼠60只，按照数字表法随机分为正常对照组、NC组（鞘内注射生理盐水）、UNC3230组（鞘内注射UNC3230）、MK-2206组（鞘内注射MK-2206），各组均按设计于每天7：00、15：00、23：00皮下注射，每次注射10L，3次/d，连续7d。
　　1.3观察指标
　　1.3.1尼古丁依赖/戒断大鼠疼痛行为学测定每日上午8：00~12：00测定，大鼠机械刺激缩足阈值（MWT）测定：借助BME-404型电子式机械刺激仪，待大鼠在测量环境中适应30min后，将端面直径0.6mm的测针对准大鼠右下肢足底皮肤，直至动物产生躲避行为，每次测量1min，反复测量5次，间隔5min以上，测量平均值即为MWT值。热刺激缩足潜伏期（TWL）：借助BME-410C型全自动热痛刺激仪，将有机玻璃箱置于3mm厚玻璃板上，大鼠适应30mm后，利用校准光对准大鼠右下肢足底皮肤，按下按钮，待灯头发出刺激强光时计时，直至动物开始躲避，停止计时。重复5次，间隔5min以上，测量平均值即为TWL值。
　　1.3.2Western blot法末次鞘内注射后 90min内各组取4只大鼠立即处死，按以上方法迅速取出L4-6脊髓节段，置于-80℃冰箱中备用。标本取齐后，按比例加入裂解液，置冰上匀浆，超声裂解。于冰上裂解30min，收集裂解液4℃，12000r离心5min，收集上清液，应用ELISA法检测PIP2含量。BCA法测定蛋白浓度后，取25ug蛋白上样。SDS-PAGE电泳，再转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭后，一抗室温孵育60min，4℃过夜。TBST洗膜后，HRP标记的二抗（1:5000）室温孵育60min，含有5%脱脂奶粉的TBST洗膜后，用滤纸将PVDF膜上多余的液体吸干，ECL化学发光试剂盒进行显色，用Image J软件对蛋白条带灰度值进行测量分析，以pAkt光密度值/Akt总蛋白光密度值反映Akt活性。
　　1.4统计学方法使用SPSS19.0软件对资料进行分析处理，计量资料采用（x±s）来表示，单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2.结果
　　2.1各组大鼠各时段TWL值比较
　　与正常对照组对比，模型组大鼠在尼古丁戒断后1~7dTWL值明显降低，且在5d时降为最低，差异有统计学意义（P<0.05）；鞘内给药后，与NS组相比，UNC3230组、MK-2206组TWL值明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　

　　3.讨论
　　吸烟和痛觉敏感性密切关系，特别是长期吸烟者可通过基因甲基化改变疼痛阈值，从而级联更为广泛的全身多系统炎性反应[7]。前期研究发现尼古丁戒断后大鼠痛觉敏感性的增高可能与脊髓小胶质细胞活化及 P2X4R—BDNF—TrkB—KCC2信号通路的激活有关，但阻断上述传导通路后，大鼠痛觉敏感性未完全恢复至正常状态，提示尚存在其他受体及信号传导通路参与。
　　PIP2不仅能维持细胞正常生理功能，还可通过调控胞膜多种通道蛋白参与随后的伤害性信号传导[8]。PIP5KIc是PIP5KIs的主要亚型之一，在人脑组织中表达最为丰富，是合成PIP2的关键酶[9]。研究证实PIP5KIc合成的PIP2是调节G蛋白偶联受体和离子通道活性的主要底物，同时大量合成的PIP2会激活下游PI3K，进而活化Akt/PKB途径引发动物痛觉改变信号通路[10-11]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过抑制或激活GSK3、NOS等下游靶蛋白，调节细胞功能[12]。PI3K/Akt信号通路可参与神经损伤的疼痛超敏，Akt硝酸化可作为伤害性神经元激活的重要标志[13]。本研究显示，NS组大鼠MWT、TWL值均较正常对照组大鼠明显降低，且在第5d将至最低，表明尼古丁戒断后大鼠痛觉敏感性增高，与相关文献[14]结果一致。鞘内注射UNC3230、MK-2206后，大鼠MWT、TWL值升高，表明PIP5K1C抑制剂、Akt抑制剂可有效改善尼古丁戒断诱发的痛觉过敏。为进一步验证，我们采用Western blot法对大鼠DRG神经元中PIP5K1c、PIP2、Akt表达进行检测，结果显示，与正常对照组相比，NS组大鼠DRG神经元中PIP5K1c、PIP2、Akt蛋白表达明显升高；与NS组相比，UNC3230组、MK-2206组PIP5K1c、PIP2、Akt蛋白表达水平明显降低，与我们的推测基本一致，表明PIP5K1c、PIP2、Akt参与了尼古丁戒断大鼠痛觉过敏的形成。原因可能为：PIP5K1c在调控神经元分化及神经突起生长中发挥重要作用，长期尼古丁依赖后戒断可引起脊髓小胶质细胞活化，并上调PIP5KIc表达，进而导致PIP2大量合成，并通过cross-talk刺激非神经元细胞相应受体产生级联反应，导致疼痛外周敏化的形成；同时，PIP2会激活下游PI3K，进而导致Akt活化，Akt能调节GSK3、NOS等多个疼痛相关的下游靶蛋白，还能激活eNOS上的Ser-1179位点，增加NO水平，参与痛觉过敏的形成于维持；另一方面能激活NF-kB，调节iNOS、细胞因子等参与中枢神经损伤及神经病理性疼痛形成过程[15-16]。
　　综上所述，PIP5K1c可通过抑制PIP2-Akt信号通路调控尼古丁戒断大鼠模型的痛觉过敏形成。
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