发育期大鼠反复惊厥中 GRP78/caspase 12 的表达及 7-NI 对其影响的研究

发表时间:2018/9/6   来源:《中国误诊学杂志》2018年7月22期   作者:王显鹤 杨占双 张洋 聂影
[导读] 7-NI 治疗能够反复惊厥可能机制是通过抑制抑制GRP78及Caspase-12 为标志的内质?网应激途径,抑制惊厥的发作,对神经系统起到初步的保护作用。

佳木斯大学附属第一医院  黑龙江佳木斯  154003
        摘要:目的:探讨分析发育期?大?鼠在反复惊厥中的状态下GRP78(葡萄糖调节蛋?白78)、Caspase-12(半胱天冬蛋?白酶12)和7-NI(7-硝基吲唑)的表达变化及7-NI 对其影响。方法:选取144 只Wistar ?大?鼠,按照随机分配的原则分成3 组:对照组、惊厥组、7-硝基吲唑治疗组,每组48 只。分别最后一次惊厥处理理后的6h、12h、24h、72h 的5 个不不同的时间点取海 ?马组织,利利用免疫组化法和半定量量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测 3 组组织内 GRP78 和 Caspase-12 表达?水平,并进?行行统计学分析。结果:免疫组化结果显示,与对照组相?比惊厥组有明显的液化灶,脑组织?水肿程度明显。对照组中 GRP78 和 caspase-12 阳性细胞数最少,其中7-NI 治疗组GRP78 阳性细胞数?高于惊厥组对照,相反caspase-12 阳性细胞数数惊厥组的表达量量?高于7-NI 治疗组,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且GRP78 阳性细胞数在12h 达到最高值,caspase-12 阳性细胞数在24h 达到最?高值,RT-PCR 结果与免疫组化结果?一致。结论:发育期?大?鼠在反复惊厥发作时GRP78(葡萄糖调节蛋?白78)和Caspase-12 表达均升?高,GRP78 表达最?高值早于caspase-12。7-NI 治疗能够反复惊厥可能机制是通过抑制抑制GRP78及Caspase-12 为标志的内质?网应激途径,抑制惊厥的发作,对神经系统起到初步的保护作用。
        关键词:发育期;反复惊厥;GRP78/caspase 12;7-NI;


        惊厥是?一种神经系统的急性危重病症,多发于幼?儿,年年龄越?小发表率越?高,短时间的抽搐对神经系统没有较?大的影响,但是?长时间抽搐严重损伤?大脑神经系统,可导致神经元的凋亡和坏死[1-3]。反复惊厥发作促使了了癫痫的发?生,并且在这?一过程中体内产?生了了?大量量的活性氧和过氧化物。
        1 材料与方法
        1.1 主要实验材料料
        21 ?日龄的健康清洁级Wista r ?大?鼠144 只购买于?长春市亿斯实验动物技术有限责任公司,吉林林省动物质量量检测合格,体重?无组间差异。氯化锂和匹罗卡品购买于 Sigma 公司,7-NI购买于梯希爱化成?工业发展有限公司,GRP78 兔抗?大?鼠抗体、Caspase-12 兔抗?大?鼠抗体、Trizol、逆转录 RT 试剂盒和PCR 试剂盒均购买于天津索罗?门?生物科技有限公司。
        1.2 实验?方法
        对照组(n=48):?无Licl-Pilo 和7-NI 处理理。
SR 组(n=48):给予 Licl-Pilo(?首剂量量为 100mg/kg·次·d)诱导惊厥,每隔?一天?一次,总共5 次,?无7-NI 处理理。
7-NI 治疗组(n=48),7-NI(100mg/kg·次·d)30min 后,Pilo 腹腔注射。
        1.2.1动物标本的制备
        最后?一次惊厥处理理后,在不不同的时间灌流固定法处死?大?鼠,取?一部分脑组织,4%多聚
        甲醛中固定24h,常规脱?水、浸蜡、?石蜡包埋和切?片,然后进?行行免疫组化,另?一部分放置于
-80℃保存备?用,?用于RT-PCR 实验。
        1.2.2 RT-PCR 法检测GRP78 和caspase-12 mRNA 的表达
        按照逆转录试剂盒说明书逆转率cDNA,以cDNA 为模板进?行行RT-PCR,按照表2 的反应体积加样,按照表3 的反应条件进?行行反应,凝胶电泳,观察PCR 结果。
        1.3 统计学分析
        ?用SPSS 22 统计软件处理理,数据以x±s 表示,样本间的?比较采?用单因素?方差分析
(One—Way ANOVA),均数的两两?比较采?用LSD 法,P<0.05 为差异有统计学意义。
        2结果
        2.1 RT-PCR 检测结果
        对照组 GRP78 和 Caspase-12 mRNA 表达较低,GRP78 mRNA 在惊厥 12h 时电泳条带最亮,?而 Caspase-12 在惊厥 24h 时电泳条带最亮,与免疫组化结果相吻合。(?见表6)
        表6  Caspase-12(OD 值)/GAPDH(OD 值)?比较(n=6)

 

        3 讨论
        多种因素可诱发新?生?儿惊厥的发?生,如若不不能及时治疗神经系统后遗症的发?生率很?高,常?见的惊厥神经系统后遗症有脑瘫、智?力力低下和癫?疒间等[10,11]。随着振幅整合脑电图、影像学检查、串串联质谱技术对遗传代谢性疾病的筛查和外科?手术的进?一步发展,新?生?儿惊厥的发现、诊断、及其治疗效率得打了了?大幅度的提?高,减少惊厥引起的神经系统后遗症的发?生[12]。
        惊厥发作导致的脑缺?血及氧化应激等作为应激源可引发内质?网应激。GRPS 是 UPR 的标志物,Caspase-12 内质?网应激的关键性分?子,两者都是内质?网凋亡过程中的关键分?子[6,7]。本研究通过免疫组化和 RT-PCR 实验共同证实了了在反复惊厥发作时时 GRP78 及 Caspase-12 均上调,但GRP78 早于Caspase-12。GRP78 在惊厥早期通过UPR 防御机制起到保护作?用,随着实验进展,防御机制发?生障碍,GRP78 表达下降,启动下游凋亡因?子 Caspase-12,Caspase-12 表达增加,促进凋亡。GRP78 在惊厥早期通过 UPR 防御机制起到保护作?用,随着实验进展,防御机制发?生障碍,GRP78 表达下降,启动下游凋亡因?子Caspase-12,Caspase-12表达增加,促进凋亡。因此,GRP78 对细胞凋亡平衡的维持?至关重要。
        氧自由基是内质网发生应激的应激源,反复惊厥是的体内自由基生成增加,诱发内质?网应激反应凋亡途径。Tominaga等证实脑缺血模型中7-NI可以为选择性nNOS抑制剂,可以抑制NO 及ONOO-对神经元的损害,起到保护神经系统的作用[8]。Huang指出,脑缺血后激活 nNOS 加剧了了DNA的氧化损伤,促进神经元凋亡的发生。并且研究证实NOD抑制剂可以下调caspase 的表达,阻碍内质网应激途径的发生,GRP78表达增加,维持了了内质?网的稳态,保护了了神经元[9]。以上结果共同证实了了反复惊厥导致脑损伤早期GRP78 通过 UPR 防御抵御脑损伤,抑制凋亡的发?生;7-NI 作为nNOS 的抑制剂,抑制氧?自由基的过多产?生,起到保护神经元的作?用。多项动物模型及临床研究证实了了?自由基损伤与多项神经系统疾病相关,抗氧化剂在神经系统疾病中的临床应?用具有重要的实际意义[3]。因此,7-NI 作为氧?自由基的抑制剂有望应?用于临床治疗神经系统类疾病如惊厥等。本实验对 7-Nl 在?大?鼠发育期反复惊厥中可能的保护作?用机制进?行行了了初步探讨,从?而为临床防治新?生?儿惊厥引起的神经系统疾病提供了了实验依据。

        参考文献:
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        [10]Silverstein F S,Jensen F E. Neonatal seizures[J]. Ann Neurol,2007,62(2):112-120.
        [11]贺芬萍,彭小明,吴运芹,等.新生儿惊厥的诊断治疗研究新进展[J].当代护?士(下旬刊),2015(05):5-7.
        [12]贺芬萍,彭?小明,吴运芹,等.新生儿惊厥的诊断治疗研究新进展[J].当代护士(下旬刊),2015(05):5-7.
        项目编号:佳木斯大学校级自然科学基础研究面上项目、项目号S2014-006

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